开放时（挤奶后或乳头受损等）进入乳腺繁殖、扩增。奶牛感染大肠杆菌后常引起急性乳腺炎，并伴随局部和全身症状。从理论上讲加强饲养管理，搞好泌乳期和产前的环境卫生，做好挤奶前后的消毒，可以降低环境性乳腺炎的发病率。但是实践证明，环境控制并没有明显降低大肠杆菌乳腺炎的发病率。有报道显示，在管理良好的奶牛场，高体细胞数（SCC）的乳汁中经常能分离到大肠杆菌[3-4]。近年来大肠杆菌乳腺炎发病率有升高的趋势，特别是在一些饲养管理水平较高的发达国家，接触性乳腺炎有所控制，而大肠杆菌乳腺炎在临床型乳腺炎中的发病率有所增加。
病原菌入侵宿主是一个复杂的、动态的多因子作用过程，从病原与宿主互作的角度深入研究病原侵染后宿主抵御病原感染的机制是控制疾病的关键所在[5]。先天性免疫系统是机体识别和清除入侵病原体的第一道防线，具有作用广泛、启动迅速的特点，在保护机体、抵抗感染的过程中具有极其重要的作用。先天性免疫系统依赖模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体的病原相关分子模式，进而招募相应的接头蛋白，激活信号级联反应，促进炎症细胞因子、趋化因子的分泌和表达，从而杀伤和清除病原微生物。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是目前在感染性疾病发病机制中研究最为广泛的的一组PRRs，在多种细胞中广泛表达。TLR定位于细胞的膜结构上广泛识别多种PAMPs，通过招募接头蛋白MyD88（myeloid differentiation factor-88）和TRIF（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β），激活NF-κB（nuclear factor-κB）和IRFs（interferon regulatory factors）信号通路[6-8]。已有研究证明大鼠乳腺上皮细胞能表达TLR2、TLR4和TLR9，在乳腺上皮细胞抵御致病均感染中发挥重要的作用[9-11]。
研究表明，饲料中来源丰富的视黄醇具有维持上皮细胞的完整性、促进动物生长、维持正常的视觉等功能。近年来，研究还发现，视黄醇能提高多种免疫细胞的功能，增强机体抗感染能力。本实验室的前期研究已表明视黄醇对LPS诱发的试验性乳腺炎大鼠具有一定的保护作用[10]，且视黄醇处理能下调TNF-α、IL-1β、iNOS等多种炎症介质的表达[12]。本试验将进一步深入探讨视黄醇抑制炎症介质表达的作用机制，为奶牛乳腺的健康调控提供一条新的思路。
1 材料与方法
1.1 大鼠乳腺上皮细胞的培养与处理
大鼠乳腺上皮细胞分离培养方法参照文献[10]并加以改进。选择妊娠15～18 d的大鼠，无菌采集乳腺组织，胶原酶与透明质酸酶联合消化分离乳腺上皮细胞，多次瞬时离心（1 000 r/min离心1 min;重复10次）收集细胞，调整密度至 5×105个/mL，接种于培养瓶中，37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞铺满培养瓶底90%以上，更换培养液为无血清培养液，同时加入药物处理。试验组加入终浓度为1 μmol/L的视黄醇（DMSO溶解），对照组更换含相等浓度DMSO的基础培养液处理24 h后，大肠杆菌（multiplicity of infection，MOI=10）处理细胞，分不同时间点用细胞刮刀刮取细胞，置于液氮后转移至-70 ℃冰箱保存。
1.2 主要试剂
乳腺炎致病菌大肠杆菌（NJ0501）由南京農业大学动物医学院泌乳生化教研室提供。PVDF膜购自Millipore公司;兔抗鼠TLR-4、NF-κB p65多克隆抗体购自Santa Cruz公司;小鼠抗GAPDH单克隆抗体购自Bioworld公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、兔抗小鼠IgG购自武汉博士德公司;ECL化学发光检测试剂盒购自Pierce公司。TNF-α、IL-1β检测试剂盒购自购于解放军总医院科技开发中心放免所。
1.3 乳腺细胞核蛋白与总蛋白的提取
参照试剂盒说明分别提取大鼠乳腺上皮细胞核蛋白与总蛋白用于EMSA及Western blot分析，蛋白样品浓度采用BCA法测定，分装后保存于-70 ℃。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 Western blot检测乳腺上皮细胞中TLR4、MyD88含量 30 μg乳腺上皮细胞总蛋白提取物经10% SDS-PAGE电泳，半干转印仪转印到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，分别在兔抗TLR-4抗体、兔抗NF-κB p65抗体（1 ∶ 500稀释）中4 ℃孵育过夜;TBST充分洗涤，在辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1 ∶ 6 000稀释）中室温孵育1 h，TBST充分洗涤后加入化学发光液，暗室曝光、显影、定影。以GAPDH为内参照，用同样方法加小鼠抗GAPDH单克隆抗体（1 ∶ 5 000 稀释）和辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG（1 ∶ 6 000 稀释）对同一PVDF进行检测。凝胶图像分析系统对条带进行光密度测定，以目的蛋白和GAPDH条带的光密度比值代表其表达的相对水平。
1.4.2 细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β含量测定 具体操作按试剂盒说明书进行。
1.4.3 RT-PCR检测乳腺上皮细胞中iNOS表达 用TRIzol试剂盒提取总RNA，用随机引物同时对所有样品进行反转录，建立各样品的cDNA。用所有待测反转录产物的混合样（每份待测样品等体积混合）对反应条件进行优化。反应条件为：95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，重复45个循环。以β-actin为内标基因，用实时荧光定量PCR进行相对定量。
1.5 数据处理
用SPSS 17.0方差分析程序对试验数据进行统计分析，统计结果以“平均数±标准误”表示。
2 结果与分析
2.1 乳腺上皮细胞TLR4、MyD88含量的变化
由图1可知，大鼠乳腺上皮细胞表面有TLR-4存在，大肠杆菌处理后30、60 min大鼠乳腺上皮细胞TLR-4表达极显著升高;与对照组相比，视黄醇处理能显著降低大肠杆菌处理60 min后大鼠乳腺上皮细胞TLR-4水平。
2.2 乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β分泌的变化
由图2可知，正常情况下，大鼠乳腺上皮细胞释放的 TNF-α、IL-1β较低，大肠杆菌刺激后大鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β释放量显著升高（P<0.05），视黄醇处理能显著降低大肠杆菌处理60 min后大鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β释放量。
2.3 乳腺上皮细胞iNOS表达的变化
由图3可知，大鼠乳腺上皮细胞经大肠杆菌刺激后iNOS mRNA表达显著升高（P<0.05），视黄醇处理能显著降低大肠杆菌处理30 min和60 min后大鼠乳腺上皮细胞NOS mRNA表达。
3 讨论
乳是乳腺的分泌产物，乳汁对新生哺乳动物的重要性毋庸置疑， 乳腺的健康是其发挥生物学效应的基本保障。但是
作为机体最大的外分泌腺，乳腺在进化、发育和泌乳再构建的过程中时刻面临着病原微生物的侵袭，乳腺感染频繁发生，尤其在奶牛产业，据报道全世界约有2/3的奶牛罹患各种类型的乳腺炎。病原菌入侵乳腺组织是一个复杂的、动态的多因子作用过程，然而目前宿主对抗乳腺感染的作用机制研究尚不深入，这是乳腺炎得不到有效控制的原因之一。
TLRs是一组保守的介导机体天然免疫反应的跨膜受体蛋白，广泛分布于髓源细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及上皮细胞等20多种细胞中[13-14]。TLRs通过识别病原微生物、偶联信号传导途径，激活天然免疫細胞，最终启动一系列的免疫炎症反应，是天然免疫系统中最为重要的模式识别受体[15-17]。TLR-4是革兰氏阴性菌及其内毒素发挥生物学效用的特异性受体[18]，TLR-4的表达可以作为革兰氏阴性菌引起的乳腺炎的生物标记分子。本研究证实原代培养的大鼠乳腺上皮细胞表面有TLR-4的存在，并且正常情况下该受体表达量较低，而大肠杆菌侵染能显著刺激TLR-4的表达，视黄醇对TLR-4的表达影响不显著。
病原微生物刺激后，位于细胞膜表面的TLR通过胞外区富含亮氨酸的重复序列将刺激信号传入胞内，活化胞核内的NF-κB[19]，并促进相关炎性细胞因子释放到胞外。在本试验中，大肠杆菌处理大鼠乳腺上皮细胞后，NF-κBp65表达活性显著升高，视黄醇预处理能极显著降低NF-κB p65表达，与先前研究结果一致，表明视黄醇能显著提高核内视黄醇受体-α（retinoid receptor-α，RAR-α）的表达，而RAR-α可以与NF-κB上的结合位点相结合，从而降低NF-κB的生物学活性[20]。
大肠杆菌或其致病因子通过TLR-4/NF-κB信号途径合成并释放细胞因子，任何NF-κB的抑制剂均能抑制其诱导的炎症相关基因的转录。TNF-α、IL-1β是LPS（脂多糖）通过TLR-4跨膜激活核转录因子后产生的重要炎性因子，LPS处理后引起各个时间点TNF-α、IL-1β的mRNA表达极显著升高，视黄醇处理能显著抑制上述基因的过度表达。iNOS（诱导型一氧化氮合酶）是NO合成的限速酶，NO是体内重要的信号分子，具有多种生物学功能，一方面NO具有直接的杀菌作用，另一方面NO能加快血液循环，促使更多的PMN（中性粒细胞）向组织迁徙发挥吞噬活性[21-22]。但iNOS持续活化产生过量NO是引起组织损伤的一个重要因素。在本研究中，LPS极显著刺激各个时间点iNOS mRNA的过度表达，视黄醇显著下调炎症反应后期该基因的表达。与先前报道一致，视黄醇能通过下调转录因子 NF-κB p65和p50亚基的活性从而降低iNOS的并表达[23-24]。
4 小结
研究表明大肠杆菌通过TLR-4/NF-κB信号途径促进原代大鼠乳腺上皮细胞炎性相关因子的表达，视黄醇能抑制NF-κB活性，抑制相关炎性因子的过度表达，这可能是视黄醇保护乳腺对抗感染的原因之一。
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