病理性瘢痕是临床上的常见病、多发病，发病机制尚未完全明了。结缔组织生长因子：connective51ssue growth factor，CTGF)是一种促纤维化生长因子，在病理情况下，CTGF的过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生、发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化等。本实验旨在通过应用免疫组化(SABC法)染色，图像分析等方法，观察CTGF在病理性瘢痕中表达的差异性，以探讨两者之间的内在关系。
1 材料和方法
1．1 标本来源及实验分组：全部瘢痕疙瘩病例均属于增生期。病例入选标准还包括：2年内未接受药物注射、放射或外科治疗；1个月内未予任何外用药治疗；无系统疾病者；无局部皮肤病变。标本均来源于本科。全部共75例，其中男33例，女42例：年龄12～63岁，平均(34±13)岁；病程1～20年，平均(8.28±7.05)年。对照组15例正常人皮肤均取自健康个体躯干上部。其中男6例，女9例：年龄12～53岁，平均(30±13)岁。实验分8组：NS组(正常皮肤组)、SS组(浅表性瘢痕组)、HSS组(增生性瘢痕边缘组)、HSM组(增生性瘢痕中间组)、HSN组(增生性瘢痕边缘外正常皮肤组)和KS组(瘢痕疙瘩边缘组)、KM组(瘢痕疙瘩中间组)、KN组(瘢痕疙瘩边缘外正常皮肤组)。所有标本切取后用PBS冲洗，修剪去皮下脂肪，经10％中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片厚5μm，分别经HE和免疫组织化学染色。
1．2 主要试剂与仪器：兔抗人CTGF多克隆抗体、既用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。真彩医学图像分析仪为德国Leica公司MD－20型。
1．3 实验方法
1．3．1 HE染色：按照常规方法进行。
1．3．2 免疫组织化学染色：采用SABC法，石蜡包埋标本、切片后，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；3％过氧化氢阻断内源性过氧化酶；0.02mol／L柠檬酸微波修复；非免疫性动物血清封闭非特异性抗原；山羊抗人CTGF多克隆抗体稀释度为1:100，4℃孵育过夜；按sP试剂盒说明加生物素标记的二抗，孵育30min后加标记过氧化酶的链霉亲和素孵育30min：DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。半数切片不经苏木精复染，留作图像分析，其余切片经苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。同时取乳腺癌及结肠癌的标本做阳性对照。显微镜观察。
1．3．3 形态计量学及图像分析：免疫组化切片的染色阳性信号为棕黄色颗粒，阴性对照片无棕黄色着色。将免疫组化切片置于相同强度光线显微镜下，观察表皮、真皮中棕黄色颗粒的表达数量及表达强度；并观测其形态及其分布特征。8组病例分别进行上述观察。每例随机抽取1张CTGF染色切片用图像分析系统分别进行检测。在40倍物镜下每张切片自表皮向真皮深层按系统抽样法随机抽取5个视野，测定棕黄色阳性颗粒的总面积及平均光密度值，然后计算出单位面积的面密度值。
1．3．4 统计学处理：用SAS8.0统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，样本两两比较用q检验对数据进行统计分析，判断均数差异显著性，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2．1 HE染色：观察结果基本与文献报道相同。
2．2 免疫组织化学染色：阳性信号主要定位于细胞浆，空白对照片无棕黄色着色。KS组织中CTGF表达阳性细胞数最多，可见大量弥漫性分布的成纤维细胞，着色较深，排列紊乱，极性消失，主要分布于真皮层胶原结节处，大部分呈强阳性着色，特别是真皮深层；表皮基底层也有少量阳性细胞，着色较淡。并且在瘢痕组织的边缘，CTGF表达呈现由强变弱的过渡现象。在KN组织中也有较强的表达。在HS组织，阳性细胞分布与KS相同，但数量少，着色较淡。主要集中于中间部。而在HN组织中的表达极微弱。SS和NS组织中仅有极微弱的CTGF阳性着色，主要在表皮基底层。
2．3 图像分析：各组CTGF阳性颗粒面密度值见表1；平均光密度值见表2。
3 讨论
3．1 CTGF是1991年Bradham等通过应用抗血小板源生长因子抗体筛选人类脐静脉内皮细胞eDNA文库基因表达时首次发现。它主要由皮肤成纤维细胞、肾小球系膜细胞、肝星状细胞、肺纤维连接蛋白、血管平滑肌细胞等间质细胞合成分泌。其作用主要表现为促进成纤维细胞增殖、介导细胞粘附、刺激细胞迁移、促进细胞存活、促进细胞外基质合成、促进细胞凋亡、促进新生血管形成、促进肉芽组织形成和纤维化、促进软骨及骨骼发育等。它被视为转化生长因子β(TGF－β)的下游反应元件，而TGF－β被认为是促进纤维化发展最重要的细胞因子，其在病理性瘢痕发病机制中所处的重要作用已被证实。在瘢痕形成过程的体内和体外实验研究中，CTGF对成纤维细胞的分化增殖，具有很强的调控作用，而CTGF的异常高表达在瘢痕形成过程的发生、发展过程中起着关键作用，已成为瘢痕形成过程新的研究热点。
3．2 本实验通过逐组图像分析，计算出能够反映CTGF蛋白阳性表达率高低的面密度值(视野中被分析物体的总面积／视场面积)和反映CTGF蛋白阳性表达强度高低的平均光密度值(整个视野中每一点的光密度的叠加／点数的总和)，以便充分显示各组中CTGF的表达差异。结果显示CTGF主要表达于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织真皮层的成纤维细胞中，且两者的阳性表达率及阳性表达强度均较正常皮肤和浅表性瘢痕中明显增强，但又有瘢痕疙瘩强于增生性瘢痕的差异，说明增生性瘢痕和瘢痕疙瘩既有瘢痕增生的共同特性，又有增生程度及活性不同的差异。同时，发现瘢痕疙瘩外一定范围的正常皮肤也有较强的表达，而与之外观极其相似的增生性瘢痕外正常皮肤表达与正常皮肤无明显差别，这预示瘢痕疙瘩具有侵袭正常皮肤的特性，而增生性瘢痕则无侵袭性。实验结果与增生性瘢痕的预后及治疗效果明显好于瘢痕疙瘩的临床事实基本一致。结果说明CTGF在病理性瘢痕发病机制中可能起到了非常重要的作用，或者说参与了病理性瘢痕的形成。
3．3 TGF－β除能诱导细胞增殖和促进组织纤维化外，尚有抗炎和抗细胞分化等功能，由于其作用的靶细胞种类繁多、生物学效应复杂，因此，完全阻断其表达或活性，可能引起细胞生长失控、免疫失调、严重炎症等不良反应。而CTGF作为TGF－β的下游介质，生物学效应较单一，可能仅介导TGE－β的促纤维化效应，其作用范围也主要局限于结缔组织。通过阻断CTGF可能减轻TGF－β诱导组织纤维化的效应，同时保留TGF－β有利的抗炎症和抗肿瘤细胞增生的效应。可以认为，CTGF是一种特异性更强并且具有选择性干预结缔组织形成过程的细胞因子。因此，应用一些阻断CTGF的表达或抑制其生物活性的物质，如抗CTGF中和抗体或CTGF反义分子等，选择性地作用于CTCF靶位，有可能成为将来治疗瘢痕疙瘩及其它纤维化疾病的更特异、更有效的方法。