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摘要：目的 觀察丹红注射液对动脉粥样硬化（AS）小鼠自噬基因Atg13启动子区甲基化及自噬信号通路PI3K/Akt/mTORC1的影响，探讨其可能的作用机制。方法 40只8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂饲料喂养6周，随机分为模型组、阳性对照组和丹红注射液低、高剂量组，每组10只，各给药组给予相应药物干预。6周后RT-PCR检测AS小鼠主动脉自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表达;Western blot检测AS小鼠主动脉Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、PI3K、Akt、p-Akt、mTORC1和p-mTORC1的蛋白表达;采用亚硫酸氢盐测序法检测AS小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平。结果 与模型组比较，丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉Beclin1蛋白表达明显升高，丹红注射液低剂量组小鼠主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高（P<0.01），丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表达显著升高（P<0.01），丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平明显降低（P<0.01），丹红注射液高、低剂量组小鼠主动脉p-Akt蛋白表达明显降低（P<0.01），丹红注射液高剂量组小鼠主动脉p-mTORC1蛋白表达明显降低（P<0.01）。结论 丹红注射液防治AS的机制可能与降低模型小鼠主动脉Atg13启动子区甲基化水平、抑制PI3K/Akt/mTORC1信号通路和促进细胞自噬有关。
关键词：动脉粥样硬化;丹红注射液;自噬;DNA甲基化;Atg13;PI3K/Akt/mTORC1信号通路;小鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）08-0046-05
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.010 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： Objective To study the effects of Danhong Injection on methylation of promoter region of autophagy gene Atg13 and autophagy signaling pathway PI3K/Akt/mTORC1 in atherosclerotic （AS） mice， to explore possible action mechanism. Methods Totally forty eight-week-old male ApoE-/- mice were fed with high-fat diet for 6 weeks. They were randomly divided into model group， positive control group， Danhong Injection low- and high-dosage groups （n=10）. The administration groups were given the corresponding drug for intervention. After 6 weeks， the mRNA expressions of the autophagy genes Atg13， Atg3 and Atg4a in AS mice were detected by RT-PCR; Western blot method was used to detect the protein expressions of Beclin1， LC3Ⅱ/Ⅰ， PI3K， p-Akt， mTORC1 and p-mTORC1 in the aorta of AS mice; Methylation level of the promoter region of autophagy gene Atg13 in the aorta of AS mice was detected by bisulfile sequencing PCR. Results Compared with model group， the protein expressions of Beclin1 in aorta of Danhong Injection groups significantly increased， LC3Ⅱ/Ⅰ expressions in aorta of Danhong Injection low-dosage group significantly increased （P<0.01）， and the mRNA expressions of Atg13， Atg3 and Atg4a in Danhong Injection groups also increased significantly （P<0.01）; The level of methylation of promoter region of autophagy gene Atg13 in Danhong Injection groups significantly decreased （P<0.01）， and the protein expressions of p-Akt in aorta of Danhong Injection groups significantly decreased （P<0.01）， the protein expressions of p-mTORC1 Danhong Injection in aorta of Danhong Injection groups high-dosage groups significantly decreased （P<0.01）. Conclusion The mechanism of Danhong Injection in preventing and treating AS may be related to decrease of methylation level of Atg13 in the promoter region in the aorta of model mice， reducing signaling pathway PI3K/Akt/mTORC1 and promoting autophagy.
Keywords： atherosclerosis; Danhong Injection; autophagy; DNA methylation; Atg13; signaling pathway of PI3K/Akt/mTORC1; mice
丹红注射液是从红花和丹参中提取纯化制作而成的中药复方制剂，具有通脉舒络、活血化瘀功效，临床上广泛应用于动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）性心脑血管疾病的治疗，具有保护血管内皮、抗炎、抗血栓、抗凋亡和神经保护等药理作用。我们既往研究结果表明，丹红注射液明显抑制AS，可能与DNA甲基化调控有关[1]，但具体机制尚不清楚。适度自噬对AS具有保护作用，通过自噬降解细胞内受损结构，以适应炎症、缺氧等环境改变[2]。DNA甲基化是AS发生的重要机制之一[3]，自噬基因及其相关信号通路基因出现甲基化修饰异常，可影响自噬，导致AS发生[4]。因此，本研究以高脂喂养的ApoE-/-小鼠为观察对象，观察丹红注射液对ApoE-/-小鼠AS主动脉自噬标志性基因和信号通路的干预作用，并通过检测Atg13启动子区甲基化水平，探讨丹红注射液抗AS可能的DNA甲基化机制。
1 材料与方法
1.1 动物及饲料
6～8周龄ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J）40只，体质量18～20 g，北京维通利华实验技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于温度20～26 ℃、相对湿度40%～70%环境，光照12 h明暗交替。高脂饲料配方为脂肪21%（W/W）、胆固醇0.15%西方类型膳食饲料。
1.2 药物
丹红注射液，山东丹红制药有限公司，批号16071028;阿托伐他汀钙片，上海辉瑞制药公司，批号017112K。
1.3 主要试剂与仪器
Beclin1抗体（批号ab62557）、LC3Ⅱ蛋白激酶B抗体（批号ab48394）、PI3K抗体（批号ab182651）、AKT1抗体（磷酸化位点S473，批号ab18206）、mTORC1抗体（批号ab32028）、p-mTORC1抗体（Ser2448，批号ab109268），美国Abcam公司;甲基化DNA检测试剂盒（批号CW2140）、DNA纯化回收试剂盒（批号CW0524）、T载体连接试剂盒（批号CW0801），北京康为世纪生物科技有限公司;qPCR试剂盒（KK4601），KAPABiosystems。SMA-1000分光光度计（美林恒通），JY300C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），K960PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司），实时定量PCR仪（ABI公司）。
1.4 分组和给药
实验小鼠高脂饲料饲养6周后，随机分为模型组、阳性对照组（3.34 mg/kg）和丹红注射液高（6 mL/kg）、低（3 mL/kg）剂量组（丹红高、低剂量组），每组10只。丹红高、低剂量分别为临床常用剂量的1、0.5倍，并按人与动物给药剂量换算系数折算成小鼠用量灌胃给药[5]，阳性对照组给予阿托伐他汀钙片药液灌胃（3.34 mg/kg），模型组给予等量生理盐水灌胃;每日1次，连续6周;12周后脱颈处死小鼠，取主动脉液氮骤冷，-80 ℃冰箱保存备用。
1.5 RT-PCR检测
分离总RNA，取2 μg RNA，使用第一链cDNA试剂盒在10.5 μL体系（50 U/μL RNA酶抑制剂0.5 μL、4 μL 5×buffer、2 μL dNTP MIX、2 μL DTT和1 μL AMV）进行反转录。采用Sybrpremix ex Taq试剂盒（Takara）扩增，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环，72 ℃再延伸5 min。定量RT-PCR中使用特異性基因表达引物见表1。数据分析采用2-ΔΔCt法进行相对量化。以mGAPDH为内参基因。
1.6 Western blot检测
取小鼠主动脉，试剂盒提取蛋白，采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，蛋白分离后恒定电流200 mA转至PVDF膜。室温5%脱脂奶粉封闭2 h，用相应的一抗（1∶1000）4 ℃孵育过夜，洗涤后换HRP标记二抗（1∶10 000）室温孵育2 h。洗涤后采用化学发光试剂盒在GE mageQuant LAS 4000 mini超灵敏化学发光成像仪显影，Gel Image ststem ver.4.00对图像进行灰度分析。
1.7 亚硫酸氢盐测序法检测
选择Atg13启动子中富含CpG的区域测序。1 μg基因组DNA使用DNA甲基化试剂盒转化的亚硫酸氢盐。上游引物5"-TTTGAAGATTTTGATGTATAGA AATATT-3"，下游引物5"-ATTATTACCCTCAAAAATA AATACCT-3"，扩增产物长度均为448 bp;使用MethPrimer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/ methprimer.cgi）设计。用SK8141-PCR对PCR产物进行纯化，克隆到pUC18-T载体系统中，转化为SK9307细胞。选择独立的白色菌落，并使用Genomelabgexp基因分析系统测序。采用亚硫酸氢盐测序DNA甲基化分析软件对测序数据进行分析。对各实验组中每个CpG位点的平均甲基化百分比进行分析。
1.8 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。计量资料用—x±s表示，组间比较方差齐时用方差分析，两两比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 丹红注射液对模型小鼠主动脉自噬标志性基因LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达的影响
与模型组比较，丹红高、低剂量组小鼠主动脉Beclin1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），丹红低剂量组小鼠主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），丹红高剂量组小鼠主动脉LC3Ⅱ/Ⅰ表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图1。
2.2 丹红注射液对模型小鼠主动脉自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表达的影响
与模型组比较，丹红高、低剂量组主动脉小鼠自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a mRNA表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图2。
2.3 丹红注射液对模型小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平的影响
与模型组比较，丹红高、低剂量组小鼠主动脉自噬基因Atg13启动子区甲基化水平明显降低（P<0.01）。结果见图3。
2.4 丹红注射液对模型小鼠主动脉PI3K/Akt/mTORC1信号通路的影响
与模型组比较，丹红低、高剂量组小鼠主动脉p-Akt蛋白表达明显降低，丹红高剂量组小鼠主动脉p-mTORC1蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。结果见图4。
3 讨论
AS是心脑血管疾病发病的共同病理基础，血脉瘀阻是心脑血管疾病的共同中医病机。活血化瘀中药丹红注射液治疗AS体现了中医“脑心同治”理论，见心病而兼治脑，见脑病同时兼顾心，符合中医整体观念异病同治思想，临床上广泛用于AS性心脑血管疾病的治疗[6]。最新研究发现，细胞异常自噬和基因的DNA甲基化修饰异常是AS发生的重要机制[7]。
自噬是细胞在自噬基因的调控下，利用溶酶体降解细胞内受损细胞器及大分子物质的过程。在AS病变早期，通过自噬降解细胞内受损结构，以适应炎症、缺氧等环境改变，延缓AS发展[8]。Beclin1是细胞自噬的关键调控因子，是自噬体形成必需分子，可介导自噬相关蛋白定位于吞噬泡，调控自噬体形成[9]。此外，微管相关蛋白前体LC3被裂解，产生一种活跃的细胞溶质形式（LC3-Ⅰ），然后被催化和結合成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的相对量可反映自噬体的量，这种LC3亚型是目前最广泛用来检测自噬体的分子标记[10]。吕燕妮等[11]应用系统生物学方法模拟分析丹红注射液中丹参与红花配伍的分子机制，其机制可能主要在细胞自噬、脂质代谢等生物学途径上协同发挥防治疾病的作用。本实验结果表明，丹红注射液可明显促进AS小鼠主动脉Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达，以及自噬基因Atg13、Atg3和Atg4a的mRNA表达。提示促进细胞自噬可能是丹红注射液抑制AS的重要机制之一。研究发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路是AS形成的重要信号传导通路，该通路激活在自噬中发挥关键的调节作用，mTOR活化后主要调控自噬基因Atg13表达[12]。我们研究结果提示，丹红注射液可能通过抑制Akt在Ser473位点的磷酸化和mTORC1在Ser2448位点的磷酸化，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性，从而促进自噬基因Atg13的表达，促进自噬，发挥抗AS作用。
既往活血化瘀抗AS作用机制研究主要集中在调脂、抗炎、保护细胞内皮、降低血液黏稠度等方面，近年来，随着基因组学和表观遗传研究在心血管研究领域的发展和深入，从DNA甲基化修饰为代表的表观遗传学角度来探讨活血化瘀中药的药理机制，为研究活血中药机制研究提供了新的思路与方法[13]。随着DNA甲基化修饰与AS之间相关性的揭示，逆转基因的异常甲基化成为治疗AS的理想靶点。我们课题组既往研究表明，丹红注射液可明显降低AS小鼠血脂水平，减少AS斑块面积，发挥抗AS作用，其机制可能与降低AS小鼠血清基因组甲基化水平、抑制AS小鼠血清学和主动脉斑块DNMT1表达有关[1]。提示丹红注射液可明显抑制AS，其机制与DNA甲基化调控有关。另有研究表明，DNMT1基因沉默后可明显改善由振动剪切刺激导致的血管内皮功能紊乱，其机制与抑制PI3K/Akt/mTORC1信号通路的活化和诱导自噬有关[14]，提示抑制DNMT1参与调控细胞自噬，发挥抗AS作用。上述提示丹红注射液抗AS的机制可能与调控自噬及相关通路有关。由于Atg13是自噬发生的关键基因，并受PI3K/Akt/mTOR信号通路调控，所以，本研究靶向Atg13的DNA甲基化修饰，探究丹红注射液调控DNA甲基化干预AS的具体机制和干预环节。结果表明，丹红注射液通过降低AS小鼠主动脉Atg13启动子区甲基化水平，促进Atg13基因表达及自噬，防治AS的机制这一过程中还可能与抑制PI3K/Akt/ mTORC1信号通路活化有关。
综上所述，丹红注射液防治AS的机制可能与降低AS小鼠主动脉Atg13启动子区甲基化水平，抑制PI3K/Akt/mTORC1信号通路，促进细胞自噬有关。具体机制尚需今后深入研究。
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（收稿日期：2019-03-19）
（修回日期：2019-04-11;编辑：华强）