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[摘要] 目的 探讨维生素 D 受体基因 Fok I 酶切位点多态性与胃癌的影响因素。 方法 随机选取2013年5月—2015年5月该院就诊的维吾尔族胃癌患者143例（A组）及维吾尔族健康对照者147例（B组），采用多聚酶链反应-限制性酶切片段长度多态性（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）方法测定维生素D受体基因Fok I酶切位点多态性，进行两组间比较。 结果 单因素Logistic回归分析显示：胃癌患者的f等位基因频率高于对照组（58.0% vs 47.3%，P<0.05）。多因素Logistic回归分析显示：带有f等位基因（Ff + ff）的受试者表现出较高的患胃癌的风险（OR值2.87）。 结论 VDR的FokI酶切位点多态性是胃癌易感性影响因素。f等位基因可能是胃癌发生的危险因素之一，而F等位基因可能是胃癌的保护因素。
[关键词] 维生素D受体；FokI酶切位点；胃癌；单因素分析；多因素分析
[中图分类号] R589 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）02（b）-0064-04
[Abstract] Objective Discussion of vitamin D receptor gene Fok I restriction site polymorphism influencing factors and gastric cancer. Methods 143 cases of Uygur patients with gastric cancer treated in our hospital from May 2013 to May 2015 were randomly selected as the group A， 147 cases of Uygur healthy people treated in our hospital at the same period were selected as the group B （control group ）， the polymorphism of vitamin D acceptor gene FokI restriction enzyme cutting site was measured by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism method，PCR-RFLP and compared between the two groups. Results The single factor Logistic regression analysis showed that F allele frequency in the gastric cancer group was higher than that in the control group （58.0% vs 47.3%，P<0.05）， multi-factor Logistic regression analysis showed that the subjects with F allele（Ff + ff）had a higher risk of gastric cancer（OR value was 2.87）. Conclusion VDR FokI restriction site polymorphisms are susceptibility factors in gastric cancer. F allele may be one of the risk factors of occurrence of gastric cancer， however， F allele may the protective factor of gastric cancer.
[Key words] Vitamin D acceptor； FokI restriction enzyme cutting site； Gastric cancer； Single factor analysis； Multi-factor analysis
胃癌是一种很常见的严重威胁人类健康的疾病，但其致病因素至今仍不清楚。维生素D受体是介导1，25（OH）2D3发挥生物效应的核内生物大分子，为类固醇激素/甲状腺激素受体超家族的成员[1]。有报道认为[2]：位于VDR基因2号外显子翻译起始密码子区域的Fok I酶切位点，其多态性影响蛋白质的正常功能，使转录效率降低，造成VDR不能有效的与1，25（OH）2D3结合，影响其生物效应的发挥，增加肿瘤易感性。但Lee等认为[3]：Fok I位点的f基因是肿瘤遗传易感基因，当Fok I位点的F基因型蛋白质转录活性显著强于f基因型时可以减少肿瘤发生几率。因此Fok I酶切位点多态性对于肿瘤的作用，目前尚无定论。同时胃癌的发生发展是否同样受到Fok I酶切位点多态性的影响，仍是争论的焦点。为此，该研究随机选取2013年5月—2015年5月该院就诊的胃癌患者143例及参加体检的健康对照者147例入组，通过对比两组受试者的Fok I酶切位点多态性差异，以期明确影响Fok I酶切位点多态性对胃癌患者的影响现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机选取2013年5月—2015年5月该院就诊的维吾尔族胃癌患者143例及参加体检的维吾尔族健康对照者147例入组，所有参与者均无血缘关系，其中男141例、女149例，年龄39～74岁（61.13±12.06）。经医院伦理委员会同意，向每一位参与者均签署知情同意书及伦理同意书并进行血液样本的采集（抽取5 mL肘静脉血液），同时完成问卷，以获得人口特征，如：年龄、性别、身高、体重、吸烟和饮酒史。吸烟者定义：每天至少抽1根烟，吸烟时间>1年；饮酒者定义：每周饮用含酒精饮料>50 g，饮酒时间>1年。胃癌患者（A组）男74例，女69例，年龄（60.82±11.83）岁，体重指数为（24.65±5.19），吸烟人数为87例，不吸烟者为56例，饮酒人数为82例，不饮酒者为61例，健康对照者（B组）男67例，女80例，年龄（61.42±12.51）岁，体重指数为（24.29±5.03），吸烟人数为81例，否认吸烟者为66例，饮酒人数为76例，否认饮酒者为71例，两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P >0.05）。
1.2 纳入及排除标准
1.2.1 胃癌病例纳入及排除标准 纳入标准：首次接受治疗的胃癌患者；经病理学明确诊断为腺癌的胃癌患者；未行手术或新辅助放、化疗及其它治疗的患者。排除标准：已行手术或新辅助放、化疗及其它治疗的患者；患有其它疾病的患者。
1.2.2 健康对照者纳入及排除标准 纳入标准：经过体检及癌筛检查未患癌及其他疾病的健康人。排除标准：经过体检及癌筛检查或临床确诊患癌或其它疾病的患者。
1.3 试验方法
①提取患者的基因组DNA，试剂盒由北京博凌科为生物科技有限公司提供。②PCR反应体系（25 μL），包括模板DNA及引物各1 μL，2×Taq Plus PCR Master Mix（北京博凌科为生物科技有限公司）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，无菌去离子水补足总体积至25 μL。③引物合成 依据文献[4]设计引物，由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。FokI上下游引物分别为：5’-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3’和5’-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3’。④FokI的扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，33个循环后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。⑤FokI酶切：产物10 μL中加入FokI限制性内切酶（Ta Ka Ra公司）1 μL（10 U），10×M Buffer 2 μL，0.1% BSA 2 μL，dd H2O 5 μL，37 ℃温水浴 1 h。⑥酶切产物用2%含有溴化乙啶琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统（BIO-RAD公司Gel DocTMXR+）分析基因型。
1.4 统计方法
采用SPSS 13.0统计软件进行计算，使用χ2 检验计数资料，以n表示，计算研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度。比值比（OR）表示相对危险度；危险因素分析采用Logistic多元回归。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 单因素分析结果
全组受试者FokI位点基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P>0.05）。两组受试者进行年龄、性别、体重指数、吸烟和饮酒史对比，差异无统计学意义（P>0.05）。Fok I酶切位点的f基因是肿瘤遗传易感基因。故将带有f位点的Ff及ff基因共同与FF基因进行对比发现差异有统计学意义（P<0.05）。f位点在胃癌患者中的含量较健康受试者升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.2 多因素分析结果
将单因素分析中有统计学意义的影响因素带入Logistic回归模型中进一步行多因素分析，结果提示：带有f等位基因的受试者患胃癌的风险是没有f等位基因的受试者的2.87倍，（OR =2.87， P < 0.05），见表2。
3 讨论
手术、化疗和放疗等常规治疗手段可以减少癌症的复发与转移，但对多数恶性肿瘤仍无法做到彻底治愈[5]。在肿瘤的治疗已进入分子生物水平的时代，如何能够从基因水平解释癌症的发生发展过程，降低癌症的发病率一直是学者们的研究方向。而基因的多态性对于肿瘤的发生发展起着重要的作用，对于基因多态性的探索就成为学者们的争论热点。
维生素D受体（Vitamin D Receptor，VDR）作为介导1，25（OH）2D3发挥生物效应的核内生物大分子，其编码基因位于12号染色体长臂1区3带上，全长约75 kb，由11个外显子和11个内含子组成[6-7]。5′端非编码区包括外显子1A、1B、1C，另外8个外显子（外显子2～9）编码VDR分子的结构部分。经过引物延伸和S1核酸酶图谱分析，显示有多个转录起始位点，外显子1B和1C不同的剪接可产生3种不同的mRNA[8]。维生素D受体多态性影响到多种正常或肿瘤组织细胞的生长和分化。相关报道表明[9-13]：维生素D受体多态性与乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌及糖尿病等的发生发展均存在关联。胃癌作为最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居全球恶性肿瘤排名第四位，死亡率居恶性肿瘤第二位，是中国癌症患者死亡的第三大原因[14-16]。维生素D受体基因多态性对胃癌发生发展的影响目前尚存争议。该研究Logistic多元回归单因素结果显示：带有f位点的Ff+ff基因在胃癌患者中的比例较健康受试者明显升高（76.2% vs 65.3%），差异有统计学意义，P<0.05。而带有F位点的FF基因在胃癌患者中比例下降（23.8% vs 34.7%）。多因素结果显示：带有f等位基因的受试者患胃癌的风险是没有f等位基因的受试者的2.87倍，（OR =2.87， P < 0.05）。提示f位点与胃癌易感性相关，可能是胃癌发生的危险因素之一，而F位点可能为胃癌发生的保护因素。这与文献报道相似[17]。
综上所述，带有f等位基因的Ff及ff基因在胃癌患者中的比例较健康受试者明显升高，而带有F等位基因的FF基因在胃癌患者中比例下降，VDR的FokI酶切位点多态性与维吾尔族胃癌易感性相关，f等位基因可能是胃癌发生的危险因素之一，而F等位基因可能为胃癌发生的保护因素。
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