摘要 [目的]研究低温胁迫对水稻幼苗DNA甲基化水平及模式变化。[方法]以水稻幼苗为材料，利用66个不同的引物组合对来自对照（CK）、4 ℃低温胁迫1 d（T1）、4 ℃低温胁迫2 d（T2）、4 ℃低温胁迫3 d（T3）和恢复2 d（T4）的水稻DNA样品进行甲基化敏感扩增多态性（MSAP）分析，探讨低温胁迫和恢复后，DNA的甲基化水平及模式变化。[结果]甲基化水平分析表明，CK、T1、T2、T3处理样本中总甲基化率分别为37.19%、33.79%、33.67%和32.67%。进一步分析表明低温胁迫处理导致水稻DNA总甲基化水平降低，然而恢复处理组（T4）减缓了这种趋势。[结论]水稻基因组部分位点的甲基化可能参与了水稻对低温胁迫的响应。
关键词 低温胁迫；水稻；甲基化敏感扩增多态性；DNA甲基化
中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0135-03
MSAP Analysis of Genomic DNA Methylation in Oryza sativa under Low Temperature Stress
WANG Ya-nan ， FAN Si-jing
（Anhui Jinpeiyin Technology Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230088）
Abstract [Objective]Effects of low temperature stress on genomic DNA methylation levels and patterns in Oryza sativa were studied.[Method]In this study， rice seedlings were used as materials to carry out MSAP analysis by using 66 different primer combinations. The experiment included a control group and four treatment groups. T1-T3 were under 4 ℃ for 1-3 days， T4 was the two-day’s recovery group after low temperature stress. [Result]The methylation levels of CK， T1， T2， T3 treatment were 37.19%， 33.79%， 33.67% and 32.67%， respectively. Further analysis showed that the level of global DNA methylation in O.sativa were decreased under low temperature stress， while normal temperature recovery treatment could alleviate the trend. [Conclusion]Methylation in some loci of rice genome may participate in response of rice to low temperature stress.
Key words Low temperature stress；Oryza sativa；MSAP；DNA methylation
低溫引起的冷应力是较常见的环境压力之一，它是影响植物生长和发育的一个主要因素。按照低温程度和植物受害情况可分为冷害（零上低温对植物的伤害）和冻害（零下低温对植物的伤害）两大类[1]。
为了应对环境变化，将植物事先暴露于低温环境中，使其获得对寒冷的耐受性，这涉及细胞代谢、组织结构的重塑、基因表达的重新编程。
DNA甲基化是生物界中普遍存在的DNA共价修饰方式。大量研究表明，DNA甲基化直接参与植物对干旱、重金属、低温等逆境胁迫的响应，调控基因的表达，从而导致植物表型发生变化[2-4]。DNA甲基化已被假设为植物表型临时变化的潜在机制之一。
目前，研究植物基因组中的DNA甲基化方法主要有甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术、亚硫酸盐测序法、焦磷酸测序法和高分辨率熔解曲线法。甲基化敏感扩增多态性技术是采用限制性内切酶Hpa II和Msp I识别DNA序列中的5′-CCGG位点进行酶切，然后对酶切产物进行接头的连接，再对PCR反应进行后续扩增片段多态性分析。由于其操作简单、重复性高，已广泛应用于多种植物DNA甲基化的研究[5-9]。
水稻是喜温作物，在其整个生长历程中，尤其是幼苗阶段，由于季节原因，经常遭遇低温冷害。低温胁迫给水稻生产造成巨大的损失，导致稻种萌发率低，幼苗生长迟缓，甚至死亡。该研究以中籼两系杂交稻品种两优9526幼苗为材料，利用甲基化敏感扩增多态性技术研究低温胁迫及恢复过程中两优9526幼苗DNA甲基化水平以及模式的变化，为深入了解水稻对低温胁迫的响应机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与处理方法
试验以中籼两系杂交稻品种两优9526为材料。筛选饱满的种子进行发芽，然后盆栽，待水稻出苗后，进行正常培养，光照100 μmol/（m2·s），光周期14 h/10 h（L/D），温度（28±2）℃。待幼苗第4片叶长出，倒三叶完全伸展时，取生长一致的幼苗进行后续试验。以正常处理为对照（CK）；4 ℃低温处理1 d为T1处理；4 ℃低温连续处理2 d为T2处理；4 ℃低温连续处理3 d为T3处理；4 ℃低温连续处理3 d后，恢复2 d为T4处理，每个处理设3次重复，取叶片用液氮冷冻，–80 ℃冰箱保存备用。
1.2 基因组DNA的提取
水稻叶片总DNA提取参照改良CTAB法[9]，DNA纯度采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，同时利用NanoDrop ND-2000超微量分光光度计测定230、260 nm处的OD值，将纯度较高的DNA放置在冰箱中保存，以备后续的酶切与PCR扩增试验。
1.3 DNA甲基化多态性分析
采用双酶切组合EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ和EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ对DNA进行酶切，具体试验操作参照Xiong等[10]的方法。酶切后的DNA采用接头进行连接，然后进行PCR扩增反应，连接的接头与PCR扩增引物在表1中列出。扩增产物经变性后采用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后的显影参照Sanguinetti法[11]采用银染显色。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫对两优9526幼苗DNA甲基化水平的影响
从图1可看出，经酶切、PCR反应扩增后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，共检测出3个甲基化类型，Ⅰ型为无甲基化或单链内甲基化，电泳结果为都有带；Ⅱ型为单链外甲基化，Hpa Ⅱ酶切位点有带，Msp Ⅰ酶切位点无带；Ⅲ型为双链内甲基化，Hpa Ⅱ酶切位点无带，Msp Ⅰ酶切位点有带。
为了检测水稻幼苗在响应低温胁迫及恢复过程中的DNA甲基化水平变化，利用66个不同的引物组合（表1）对来自对照（CK）、低温胁迫1 d（T1）、低温胁迫2 d（T2）、低温胁迫3 d（T3）和恢复2 d（T4）处理组的水稻幼苗DNA样品进行MSAP分析。CK、T1、T2、T3、T4处理组DNA甲基化图谱中总扩增位点数分别为1 835、1 808、1 806、1 812和1 830（表2）。從低温胁迫处理前后甲基化率 [（Ⅱ + Ⅲ）/（Ⅰ + Ⅱ + Ⅲ）×100%]和全甲基化率[Ⅲ/ （Ⅰ+ Ⅱ + Ⅲ）× 100%]的变化来看，低温处理导致水稻幼苗DNA总甲基化水平、全甲基化水平降低；而恢复处理组（T4）减缓了这种趋势，DNA总甲基化、全甲基化水平均有所回升。
2.2 低温胁迫过程中两优9526幼苗DNA甲基化模式的变化
经低温处理后，水稻幼苗DNA甲基化的变化主要分为3类，共包括13种带型，其中A类带型（A1～A3）是表示单态性的甲基化位点，即对照与处理间的甲基化位点一致、无变化；B类带型（B1～B5）是指发生去甲基化的位点，与对照相比，经低温处理后，原先甲基化的位点发生了去甲基化，甲基化位点数有所减少；C类带型（C1～C5）是指未甲基化或单链外甲基化的位点发生了超甲基化，即与对照相比，原先甲基化或单链外甲基化的位点经低温处理后发生了超甲基化，甲基化的总位点数有所增加。从表3可以看出，与对照相比，随着低温胁迫时间的增加，水稻幼苗基因组中发生DNA甲基化的位点数逐渐降低，而恢复处理改变了这种趋势。由此可见，低温胁迫主要诱导植株发生较高比例的去甲基化。进一步分析低温造成的DNA甲基化多态性位点发现，产生的超甲基化（C3、C4、C5型）带型是主要的多态性带型（图2），分别占总甲基化位点数的7.33%、7.69%、7.40%。
3 讨论
DNA甲基化是植物正常生长发育所必需的，甲基化水平不足或过高，都会导致植物生长发育不正常和形态结构异常[12]。研究表明，非生物胁迫（热胁迫、重金属胁迫、盐胁迫等）对DNA的甲基化水平会造成影响[13-15]。Kovarik等[15]的研究表明，盐和渗透胁迫可诱导烟草悬浮细胞的异染色质区发生超甲基化，而恢复正常条件后，发生超甲基化的位点又会去甲基化，可见，基因组的甲基化、超甲基化可能是植物适应非生物胁迫机制的内在反应。该试验中，在低温处理后，利用MSAP分析方法检测发生甲基化和超甲基化的位点，说明DNA甲基化反应可能参与了水稻对低温胁迫的响应。
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