摘 要 利用pCAMBIA3300载体为背景，构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体pCambia-hpRNA-CV，通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜，并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂（PPT）筛选、PCR检测。结果表明：获得转基因番木瓜植株5株，且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验，结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性，说明hpRNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。
关键词 番木瓜；嵌合型ihpRNA；花粉管通道法转化；PRSV
中图分类号 Q949.759.6 文献标识码 A
Abstract A plant expression vector containing the chimeric hairpin RNA designed to target two sequences from the CP gene and the VPg gene of PRSV was transferred into papaya plants through pollen-tube pathway， which was constructing base on the pCAMBIA3300 vector. A total of 5 positive transgenic papaya plants were obtained after PPT-resistant selection and PCR analysis. RT-PCR experiments proved that the target segment expressed in the transgenic plants. The result of PRSV challenge-inoculation confirmed the 5 positive transgenic papaya plants didn"t displayed symptoms and showed different degrees of resistance to PRSV. It’s shown that hpRNA-CV vector interferes the replication of the virus gene successfully. The research provides an effective method for PRSV resistance-breeding of papaya.
Key words Papaya；IhpRNA；Pollen-tube pathway；PRSV
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.011
番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是热带、亚热带地区的毁灭性严重的病害，一直威胁着番木瓜种植业和加工产业的发展。目前，常规育种方法还难以防控PRSV。随着基因工程抗病分子育种的发展，国内外研究人员先后将PRSV外壳蛋白、复制酶等基因导入番木瓜获得了不同的抗PRSV的转基因株系[1-2]，但研究结果发现由于各地区PRSV病毒株存在差异，导致一个地区的转基因植物在另一个地区种植表现出的抗病能力减弱，甚至抗性丧失。因此，培育出稳定、高抗、谱抗且安全性好的新品种对发展中国番木瓜产业具有重要意义。
RNA干扰（RNA interference， RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。外壳蛋白（Coat Protein， CP）基因介导的病毒抗性是研究最早的，也是目前应用最多的抗病毒基因工程，主要的研究集中在体外构建重组CP基因表达框，然后转化植物，继而使植物获得对该病毒的抗性[3]。VPg是PRSV一种约25 ku的多功能蛋白，参与病毒侵染过程中的几个阶段，包括病毒RNA的复制、病毒细胞间和长距离运输[4-9]，在病毒侵染过程中具有重要作用。在多种病毒侵染植物的过程中发现，蛋白质合成起始其重要作用的真核翻译起始因子eIF4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E）[10]与病毒基因组连接蛋白（Viral genome-linked protein， VPg）的相互作用是病毒侵染植物的必须条件[4，9，11]。在前期的研究工作中，为了获得高抗、谱抗的转基因抗PRSV番木瓜，构建了靶向PRSV基因上2个部位CP和VPg的嵌合型ihpRNA结构[12]，本研究将通过花粉管通道法将该嵌合基因的iphRNA植物表达载体遗传转化番木瓜，获得了对PRSV具有明显的抗病特性的转基因植株，为培育具有中国自主知识产权、高抗谱抗环斑病毒番木瓜新品系提供了基础材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 选取种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所试验基地的番木瓜品种“穗中红”作为转化受体材料。
1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株、植物表达载体pCAMBIA3300均由本实验室保存。
1.1.3 酶与试剂 各种限制性内切酶购自Ferments公司，PCR Mix购自TaKaRa公司，质粒、DNA和RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。
1.2 方法
1.2.1 PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA植物表达载体的构建与鉴定 利用重叠PCR技术，基于PRSV海南分离株CP基因和VPg基因保守序列，设计引物，扩增具有嵌合CP基因和VPg基因的嵌合型ihpRNA结构[12]。然后利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点，将嵌合型ihpRNA结构插入pCAMBIA3300植物表达载体（图1），命名为pCambia-hpRNA-CV。采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶对构建的pCambia-hpRNA-CV进行双酶切鉴定。
1.2.2 质粒大量提取和纯化 按照QIAGEN质粒大量提取试剂盒方法进行提取，获得的质粒DNA溶于ddH2O中，终浓度为1 μg/μL，A260/A280比值为1.8左右，于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3 花粉管通道法遗传转化番木瓜 选取数朵未开苞的两性花（作为转化用的花粉源）置于冰上，在待转化株（雌株）上选定30朵左右未开苞的花（剪去同一花柄上其余花朵），小心逐一剥开花瓣，用微量移液器在雌花花蕾柱头中央点入3～4 μL重组质粒溶液（1 μg/μL），立刻取预置于冰上的供体两性花3～4枚雄蕊于柱头上，合上花瓣，完成人工授粉后套上牛皮管袋隔离保湿，挂上标签（注明导入质粒名称、导入日期及操作时间）；（同时用ddH2O为对照，也按上述要求作同步平行操作）。第7天去除牛皮管袋，清除枯萎花苞及其标签，并登记正常生长的子房数。为保障转基因操作番木瓜果实生长所需营养的供给，剔除植株顶端其他未进行转化操作的花及果实。待果实发育成熟，统计转化果实发育座果率。将果实沿中央线纵切开，取出种子，去除假种皮后稍作晾干，播种沙床上育苗。
1.2.4 利用除草剂PPT对转化番木瓜种苗进行初筛 待转化番木瓜种苗第一片真叶伸展开时，利用120 mg/L PPT（1 L溶液中加入20 μL表面活性剂）涂抹幼苗叶片表面及生长点，隔天再涂抹1次。一周后观察叶片反应，剔除叶片变枯黄的株系。
1.2.5 PCR鉴定抗性番木瓜种苗 采用Qiagen DNA提取试剂盒提取转基因番木瓜抗PPT种苗DNA，利用基因片段两侧引物P1/P2（P1：5′- TTGGTGACGTGCGAAATAGA-3′；P2：5′-TCCAG
ACATATCTGGCTGTATTTTTTTAAT-3′）。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸6 min。PCR产物利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.6 RT-PCR鉴定抗性番木瓜种苗 采用Qiagen RNA试剂盒小量提取其RNA，-80 ℃保存备用。采用Tiangen公司KR106-2试剂盒进行反转录，以引物P1/P2进行PCR扩增反应。PCR反应程序为：98 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
1.2.7 PRSV接种攻毒试验 使用本实验室分离保存的PRSV-HN株系，通过人工摩擦接种的手段侵染番木瓜植株。选择长势相似的番木瓜植株，用清水将叶片冲洗干净，并保持液面干燥。用0.1 mol/L PBS缓冲液（pH7.0）制备PRSV-HN病毒液。取保存PRSV-HN菌株的叶片用PBS液体比例为1 ∶ 10（W ∶ V），研磨成汁，低速离心后，取上清液做为毒源，冰上放置待用。病毒液中加入适量灭菌好的石英砂，混匀；用带乳胶手套的手指蘸取病毒液，沿同一方向轻轻摩擦转ihpRNA番木瓜叶片背面，直至可见少量轻微擦痕。以转pCambia3300的转基因番木瓜为阴性对照。接种5 min后，用无菌水冲洗叶片上多余的病毒液和石英砂；40 d内以每周为时间间隔，观察病害发生情况并统计数据。
2 结果与分析
2.1 pCambia-hpRNA-CV植物表达载体的鉴定
将获得的具有pCambia-hpRNA-CV的转化菌落，扩大培养后提取其质粒。由图2可知，工程载体质粒经PCR扩增后获得了预期大小的目标条带；利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切结果显示得到了目标条带，初步鉴定转化菌落是正确的；将此单菌落送往测序，测序得到的核苷酸序列与目标序列一致。因此，表明目标片段已插入载体中，工程载体构建成功。
2.2 转化番木瓜抗PPT种苗的筛选
为得到合适的用于筛选转化番木瓜苗的PPT浓度，将不同浓度PPT溶液涂抹于野生型番木瓜种苗的第一片展开的真叶，3 d后即可观察叶片出现不同程度的萎蔫。由图3可知，对照组新叶生长良好，PPT在30～60 mg/L浓度时，处理真叶出现黑斑，叶片萎蔫，但仍有绿色；而PPT浓度达到120 mg/L时，新长成的真叶即可全部萎蔫，效果最佳。一周后，对照组叶片生长旺盛，处理组叶片死亡，没有新叶发出。因此，选择120 mg/L PPT溶液作为筛选浓度。
将筛选获得的最佳浓度的PPT溶液涂抹于转化种苗第一片展开的真叶上，一周后去除叶子变枯的植株，统计获得的番木瓜抗性苗。由表1可知，获得番木瓜转化抗性苗41株，转化植株筛选效率为17.6% 。
2.3 转化ihpRNA番木瓜种苗PCR鉴定
将抗生素筛选为阳性的41株番木瓜幼苗移栽入温室，作为检测对象，以提取的叶片基因组DNA为模板，以插入片段两侧引物进行PCR扩增，同时以载体质粒作为阳性对照模板，以转化有背景载体pCambia3300的转基因植株作为负对照（没有目标条带的出现），进行PCR扩增检测，将获得目标大小片段的转化番木瓜植株作为阳性株系（图4），本实验最终获得pCambia-hpRNA-CV转基因苗5株。
2.4 转化ihpRNA番木瓜种苗RT-PCR验证
提取PCR鉴定为阳性的5株番木瓜植株叶片RNA，经反转录后，进行RT-PCR检测。结果显示：筛选获得的转基因植株均表现为阳性，目标片段在转基因植株内获得稳定表达，目标片段成功转入番木瓜内（图5）。转基因植株在形态、生长发育状态等方面与非转基因植株无明显差异。
2.5 转基因植株抗病性分析
通过分子检测鉴定为阳性转基因株系生长至约50 cm高时，接种PRSV病毒，3周后发现，对照组（转pCambia3300株系，见图6-A）番木瓜植株顶部叶片出现明显的番木瓜环斑病症状，叶片由刚开始出现水渍斑点，逐渐叶片开始卷曲，新生叶片也出现卷曲，呈发病状态；ihpRNA载体的植株发病时间晚于对照组（图6-C、D），且发病症状明显减轻，有的株系新生叶逐渐回复正常。
3 讨论与结论
运用RNAi干扰技术进行植物抗病毒工程，通常都是针对目标基因单一位点的RNAi干扰载体的构建，但病毒基因组小，变异周期相对较短，因此采用针对单一位点的干扰不能满足实践需要。本研究采用的嵌合型ihpRNA载体具有可同时靶向多个基因或一个基因的多个部位的优点，这就可能增强转基因植株对目标基因的干扰效率；另一方面，即使生物体发育过程中基因发生位点突变，嵌合型ihpRNA结构仍然能够对其进行有效的干扰。
针对抗PRSV病毒的育种工作已有多年，基本都是围绕CP基因和PRSV复制酶基因展开的，主要的研究集中在体外构建重组CP基因表达框，然后转化植物，继而获得对该病毒的抗性[12]。国内外很多学者针对番木瓜PRSV病毒展开了研究，也取得了一定的成果。夏威夷大学的科学家们[13]将温和突变体PRSV-CP基因导入番木瓜，成功获得抗PRSV的转基因植株，在2 a内无症状，但其抗性水平较低。张帆等[14]针对PRSV-CP基因设计dsRNA介导的转化番木瓜植株，结果表现为抗PRSV。虽然这些转基因番木瓜能够抗PRSV病毒，但其抗性范围窄，而且PRSV株系存在显著区域差异。针对番木瓜转基因育种中的这些问题，本研究针对PRSV海南分离株，采用融合基因（CP基因和Vpg基因）构建ihpRNA载体，进而转化番木瓜，以期获得广谱的抗病性番木瓜；通过本实验结果显示：转基因植株具有明显的抗病活性，但其抗病活性能持续多久，后代是否会产生衰减现象，有待于进一步研究。
对于番木瓜的遗传转化来说，由于其再生体系尚不完善，转化率低，利用愈伤组织农杆菌及基因枪转化率低，很难获得转基因植株。这些条件的限制使得农杆菌、基因枪法转化体系在番木瓜育种中很难得到推广；另一方面，番木瓜是两性株、花型大、种子丰富（每个果实少则数十颗，多则数百颗种子，能够保证获得足够的转化种子）、收获周期短等性状特征，使得利用花粉管通道法进行番木瓜遗传转化成为较好的遗传转化方法。此外，子房滴注法操作简单，不需要昂贵的仪器设备，易于被育种工作者所掌握，便于此项技术的大面积推广应用。
参考文献
[1] Tecson Mendoza E M， Laurena A C， Botella J R. Recent advances in the development of transgenic papaya technology[J]. Biotechnol Annu Rev， 2008， 14： 423-462.
[2] Gonsalves D. Control of papaya ringspot virus in papaya： a case study[J]. Annu Rev Phytopathol， 1998， 36： 415-437.
[3] 郭兴启， 范国强，尚念科. 植物抗病毒基因工程育种策略及其发展[J]. 生命科学研究， 2000， 24（4）： 112-117.
[4] Schaad M C， Anderberg R J， Carrington J C. Strain-specific interaction of the tobacco etch virus NIa protein with the translation initiation factor eIF4E in the yeast two-hybrid system[J]. Virology， 2000， 273（2）： 300-306.
[5] Leonard S， Plante D， Wittmann S， et al. Complex formation between potyvirus VPg and translation eukaryotic initiation factor 4E correlates with virus infectivity[J]. J Virol， 2000， 74（17）： 7 730-7 737.
[6] Khan M A， Miyoshi H， Ray S， et al. Interaction of genome-linked protein（VPg）of turnip mosaic virus with wheat germ translation initiation factors eIFiso4E and eIFiso4F[J]. J Biol Chem， 2006， 281（38）： 28 002-28 010.
[7] Grzela R， Strokovska L， Andrieu J P， et al. Potyvirus terminal protein VPg，effector of host eukaryotic initiation factor eIF4E[J]. Biochimie， 2006， 88（7）： 887-896.
[8] Miyoshi H， Suehiro N， Tomoo K， et al. Binding analyses for the interaction between plant virus genome-linked protein（VPg）and plant translational initiation factors[J]. Biochimie，2006， 88（7）： 329-340.
[9] Roudet-Tavert G， Michon T， Walter J， et al. Central domain of a potyvirus VPg is involved in the interaction with the host translation initiation factor eIF4E and the viral protein HcPro[J]. J Gen Virol， 2007， 88（3）： 1 029-1 033.
[10] von der Haar T， Gross J D， Wagner G， et al. The mRNA cap-binding protein eIF4E in post-transcriptional gene expression[J]. Nat Struct Mol Biol， 2004， 11（6）： 503-511.
[11] Beauchemin C， Boutet N， Laliberte J F. Visualization of the interaction between the precursors of VPg， the viral protein linked to the genome of turnip mosaic virus， and the translation eukaryotic initiation factor iso 4E in Planta[J]. J Virol， 2007， 81（2）： 775-782.
[12] Yan P， Wang S C， Shen W T， et al. Simple construction of chimeric hairpin RNA for virus resistance in plants[J]. Journal of Virological Methods， 2010， 166（1-2）： 101-105.
[13] Fitch M M， Manshardt M R， Gonsalves D， et al. Transgenic papaya plants from agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J]. Plant Cell Report， 1993， 12（2）： 245-249.
[14] 张 帆， 江 玲. dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究[J]. 植物科学学报， 2011， 29（3）： 385-391.