摘 要： 采用Plant CARE和PLACE软件分析预测水稻Os05g0442400基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件。结果显示，在起始密码子ATG上游1500bp区域内，除了启动子基本的核心作用元件外，还存在一些与植物抵御非生物胁迫过程有关的作用元件、脱落酸应答元件、光诱导启动子作用元件、病原菌诱发因子作用元件，以及根特异性结合位点。采用根癌农杆菌介导法成功将Os05g0442400 promoter：：gus构建导入“中花11”水稻。由不同组织部位GUS染液检测表明：在水稻苗期，内源Os05g0442400基因可能主要在根部表达；随着水稻生殖期的延续，水稻内源Os05g0442400基因在颖壳中的表达区域由上向下面积增大，并在抽穗后达到最大表达区域。这些结果可能与Os05g0442400基因启动子上分别存在根特异性结合位点和光诱导启动子作用元件具有一定的联系。
关键词： 水稻； Os05g0442400基因； 启动子； 顺式作用元件； 转基因； GUS报告基因
中图分类号： Q 341 文献标识码： A 文章编号： 1000-5137（2013）02-0186-06
转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。植物转录因子家族成员非常庞大，根据转录因子DNA结合结构域的结构划分，可分为许多典型的转录因子家族，如bZIP类转录因子[1]、AP2/EREBP转录因子[2]、MYC转录因子[3]、MYB转录因子[4]等。其中MYB转录因子广泛参与植物生长发育、代谢的调节，以及植物激素的信号转导等过程。
Baranowskij等从马铃薯cDNA表达文库中克隆出一种新的MYB蛋白基因——MYBST1，用CaMV 35S最小启动子融合MYBST1蛋白不同DNA结合域，引导GUS报告基因（gus）及MYBST1基因编码序列构建了几种不同的表达载体并转化烟草，结果发现含有MYBST1亲和结合域的启动子能够引导GUS在烟草中高效表达，证明了MYBST1蛋白是一种转录激活因子[5]。Rose等人在番茄中也发现了一种MYBST1型的蛋白——LeMYBI蛋白，同样用CaMV 35S最小启动子引导GUS报告基因及LeMYBI基因编码序列构建表达载体并转化烟草，证明LeMYBI蛋白也是一个转录激活因子[6]。这种类型的MYB转录因子能够激活最小启动子的转录。目前在水稻中尚无此类型MYB转录因子的相关报道，为此，本文作者研究了水稻中与Mybst1、LeMYBI具有高同源性的Os05g0442400，分析了Os05g0442400基因启动子的顺式作用元件，并用pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus表达载体转化水稻，研究该基因的表达特性。开展本试验，一方面可以进行Os05g0442400基因的器官组织定位，以便更好地研究这一新基因及其编码的蛋白；另外一方面可为水稻基因工程研究中需要选择特殊类型的启动子奠定基础。
1 材料与方法
1.1 水稻受体材料和转化载体
以粳型水稻品种“中花11”（Oryza sativaL。japonica cv。Zhanghua11）为供试水稻。本研究使用的pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus双元载体T-DNA上，含有由CaMV 35S启动子引导的潮霉素抗性基因hpt，以及由水稻Os05g0442400基因启动子引导的GUS报告基因gus（图1）。该载体由复旦大学葛晓春副教授馈赠。
1.2 水稻Os05g 0442400基因启动子区域序列分析
采用Plant CARE（http：//bioinformatics。psb。ugent。be/webtools/plantcare/html/）和PLACE软件（http：//www。dna。affrc。go。jp）对Os05g0442400基因启动子顺式作用元件进行预测分析。
1.3 载体pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus转化水稻
将构建好的载体pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus导入根癌农杆菌EHA105中。主要按照李建粤等的方法[7]，以根癌农杆菌介导法对“中花11”水稻幼胚诱导的愈伤组织进行转化。
1.4 转基因水稻的分子检测
以TPS法提取水稻叶片全基因组DNA为模板，根据Os05g0442400基因序列设计引物，Forward primer：5"-AGTGGGATTGTGCGTCAT-3"和Reverse primer：5"-CAGCGGGCAGGATAAGAT-3"，以pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus质粒为阳性对照，以未转化的水稻“中花11”为阴性对照，进行PCR检测。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃45 s、52 ℃1min、72 ℃45 s、32个循环，72 ℃保温10min。预计pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus质粒和转基因植株能够扩增出一个977bp的条带。扩增后取5 μL产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
1.5 T0代转基因水稻植株不同时期部分组织器官的GUS活性组织化学分析
按Jefferson（1987）的方法[8]，用GUS染液对T0代转基因水稻植株不同时期部分组织器官进行GUS染色分析。
2 结果与分析
2.1 水稻Os05g0442400基因启动子区域序列分析
起始密码子ATG上游1.5 kb序列预测分析结果显示，Os05g0442400基因启动子内存在多种类型的顺式作用元件（图2）。除基本的启动子核心作用元件TATA盒和CAAT盒外，还含有一些可能与植物抗逆有关的顺式作用元件，如：1个MYB结合序列MBS（-1142 ～ -1137）、1个HSE（-525 ～ -516）、2个ARE（-424～ -419，-980 ～ -975）、1个脱落酸应答元件ABRE（-333 ～ -323）；光诱导启动子的作用元件，如：3个SP1（-129 ～ -124，-453 ～ -434，-1381 ～ -1376）、1个Pc-CMA2c（-1474 ～ -1466）、1个GA-motif（-396 ～ -390）、1个CATT-motif（-1289 ～ -1284）、1个Box-4（-733 ～ -728）、1个Box-I（-1152 ～ -1146）、1个ATCC-motif（-848 ～ -841）；一些与病原菌诱发因子表达调节有关的作用元件，如：3个GT-1结合序列（-669 ～ -664，-1053 ～ -1048，-1269 ～ -1264）、1个ASF-1结合序列（-1411 ～ -1407）、2个MYBST1元件（-482 ～ -478，-803 ～ -799）；以及一个根特异性结合序列Root specific motif（-1056 ～ -1052）。
2.2 转基因水稻的获得及分子检测
经根癌农杆菌介导的遗传转化后，共有20棵T0代植株从独立愈伤组织再生出苗。采用PCR检测显示，所有转基因植株和pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus质粒都能扩增出977bp大小的条带，而非转基因植株则没有相应的条带（图3）。
图3 部分转化pCAMBIAI1301-Os05g0442400 promoter-gus载体T0代转基因植株PCR检测
2.3 T0代转基因水稻植株不同时期部分组织器官的GUS活性组织化学分析
剪取苗期T0代PCR检测呈阳性的部分植株叶片及根，用GUS染液进行染色。结果发现，在转基因植株的根部，GUS显色特别明显（图4A）；在叶片表面没有GUS着色，但在叶片切口处也有GUS显色（图4B）。
在水稻进入生殖生长期时，选取剑叶节在倒二叶节下方8cm左右水稻的幼穗，及剑叶节在倒二叶节下方5cm左右的小花，进行GUS染色。观察染色结果发现，小穗的枝梗上GUS都能够显色（图5A）；在颖壳上，GUS显色部位主要在颖壳的顶端，而且在不同生长时期的颖壳都有GUS显色现象，并且随着水稻生长时期的延续，颖壳顶端GUS显色区域由顶端向下延伸（图5B）。同时，还对扬花时的小花进行GUS染液染色，并在解剖镜下观察了该时期小花内部GUS着色情况。结果发现，该时期小花内部结构也有部分GUS着色，主要分布在浆片和柱头上。
以“中花11”非转基因水稻种子以及转化CaMV 35S：：gus构建的转基因水稻种子为对照，对Os05g0442400promoter：：gus转基因T0代植株上收获的T1代成熟种子进行GUS检测时发现，在组成型CaMV 35S启动子引导下，转基因水稻种子中的GUS基因能够全部表达，而由Os05g0442400启动子引导的GUS基因，在种子中表达量较低，只有在个别种子种皮边缘或胚部略有GUS染色（图6）。
3 讨 论
MYB转录因子在植物应答、生物和非生物胁迫过程中起着非常重要的作用[9]。胁迫功能基因的表达受启动子中顺式作用元件及转录因子的调控。在胁迫条件下，转录因子与胁迫应答基因启动子的顺式元件结合，特异地启动应答基因的转录表达，从而做出调节反应。
基因表达位点分析对于指导基因工程研究中启动子的选择具有重要的参考价值。本研究发现，由Os05g0442400基因启动子引导GUS报告基因的表达载体转化水稻，转基因植株的幼苗期，GUS着色在根部最为明显。由此推测，水稻内源的Os05g0442400基因在幼苗期也可能主要在根部表达。由转基因水稻生殖发育期小花GUS检测结果推测，水稻内源Os05g0442400基因主要在颖壳尖部表达，而且随着生殖时期的延续，水稻内源Os05g0442400基因在颖壳中的表达区域由上向下面积增大，在抽穗后的颖壳中表达范围最大。这些结果可能与Os05g0442400基因启动子上分别存在根特异性结合位点和光诱导启动子作用元件具有一定的联系。
通过本研究证实，Os05g0442400基因的启动子不仅可以作为改良苗期根部性状或抽穗后颖壳性状基因工程研究中的候选启动子，引导外源基因在水稻苗期根部或抽穗后的颖壳中高效表达。而且，从转基因水稻成熟种子GUS检测结果推测，在碾米加工去除种皮和胚后，精米中无GUS显色，这对于不希望在稻米食用部位表达的水稻基因工程研究，Os05g0442400基因启动子也是一个值得选择的启动子。
启动子中是否具有病原诱导型作用元件对于植物的抗病性表现是非常关键的。目前已有一些关于启动子病原诱导型作用元件应用方面的报道。Lv等通过融合小麦Act1基因的启动子核心元件，以及马铃薯和小麦Gst1基因启动子区受病原菌调控的顺式作用元件序列而人工构建了具有稻瘟菌诱导活性的嵌合启动子[10]。在本研究中通过对启动子各个元件的分析也发现，Os05g0442400基因启动子含有一些与病原菌诱发因子表达调节有关的作用元件，如：GT-1结合序列、ASF-1结合序列、MYBST1元件等。这些作用元件是否能够应用于水稻抗病基因工程还有待于进一步的研究。
Os05g0442400基因启动子还含有ABA响应元件ABRE，以及干旱响应元件MBS，我们推测，该基因可能还参与水稻对干旱胁迫的应答反应。在逆境胁迫环境中，转基因植物表现出高效的抗逆性，而在正常环境中，抗逆性表达很弱或者不表达。要求转基因植物能表现出上述的性状，就应该选用诱导型启动子[11]。如将拟南芥rd29A基因的启动子与GUS基因连接导入烟草，GUS活性组织染色等分析表明，GUS基因的表达受干旱等胁迫因素的诱导。分析表明，Prd29A也包含干旱响应因子ABA（ABRE）[12]。在rd29A基因受到ABA诱导时，ABRE独立起作用[13]。关于Os05g0442400基因启动子的ABRE和MBS调控元件对该基因表达是否存在调控作用，也需要相关试验进行验证。
致谢：本研究使用的pCAMBIA1301-Os05g0442400 promoter-gus表达载体由复旦大学生命科学学院葛晓春副教授馈赠，特此致谢。
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Analysis of the rice Os05g0442400 gene promoter and
expression of the GUS fusion gene under control of the rice Os05g0442400
gene promoter in transgenic rice
SONG Yae1， ZHANG Hongmei2， LI Jianyue1*
（1.College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China；
2.The Shanghai Minhang District Third Middle School，Shanghai 200240，China）
Abstract： The promoter sequence of the rice Os05g0442400 gene was analyzed using Plant CARE and PLACE programs。Except the basic promoter cis-acting elements，several cis-acting elements，including the elements that related to plant resistance to abiotic stress，light-inducible promoter elements，pathogen-induced factor elements and the root specific motif，were recognized in a 1500bp promoter sequence upstream of the initial codon ATG。The Os05g0442400 promoter：：gus contruct was transferred into rice successfully by Agrobacterium tumefaciens-mediated。The GUS expression in different tissues was assayed using GUS staining。The results showed that endogenous Os05g0442400 gene may mainly expressed in roots。With the continuation of rice reproductive stage，the expression area of Os05g0442400 gene in rice glume increased from top to bottom，and after heading the expression area reached the maximum。These results may have some contact with the root specific motif and light-inducible promoter elements of Os05g0442400 gene promoter。
Key words： rice；Os05g0442400 gene；promoter；cis-acting elements；transgenic；GUS reporter gene
（责任编辑：顾浩然）