本研究考察了人参三肽（PGP3）对脂多糖（LPS）诱导BV-2小胶质细胞炎症的抑制作用。利用MTT法观察人参三肽（0.1， 1， 10， 100 μM）对细胞存活率的影响；Griess法检测一氧化氮（NO）的释放；酶联免疫法检测TNF-α的水平；并利用试剂盒检测了超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的水平。结果发现人参三肽在不影响细胞存活率的情况下，减少了活化小胶质细胞N0和TNF-α的释放，并提高了抗氧化水平。提示人参三肽可能通过提高抗氧化能力抑制LPS诱导的BV一2小胶质细胞NO释放，发挥抗炎作用。本研究为进一步开发人参治疗神经退行性疾病提供理论依据。
人参三肽；小胶质细胞；神经炎症；一氧化氮
S567.51 A 10.11974/nyyjs.20160631001
人参根中成分复杂，目前的研究主要集中于人参皂苷成分上，蛋白质及多肽的研究相对较少。研究发现用人参蛋白成分具有调节血脂、降低疲劳、抗应激、增强免疫能力及抗癌的作用[1-2]。课题组前期研究发现人参肽类成分能够增强小鼠学习记忆能力，采用凝胶柱与HPLC对人参多肽进行分离纯化，并测定了氨基酸序列，首次得到了结构明确的序列为Gln-Thr-Ser的人参三肽[3]。小胶质细胞异常活化能够介导神经炎症反应，在如老年痴呆、帕金森病等多种神经退行性疾病的发病过程中扮演了重要角色。过度活化的小胶质细胞以释放细胞因子如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和自由基等为主要特征，造成中枢神经系统（CNS）的损伤[4]。本实验通过建立体外LPS激活BV-2小胶质细胞异常活化的模型，主要考察了人参三肽的抗神经炎症及神经保护作用，为阐明其在以抑制小胶质细胞活化为靶点防治炎症相关的中枢神经退行性疾病中的应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 主要实验材料和试剂
人参三肽（PGP3），来自吉林省中医中药研究院；BV-2小鼠小胶质细胞株来自宁夏医科大学。脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司；DMEM、胰酶、胎牛血清、MTT购于Gibco公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
倒置显微镜，南京光学仪器厂；多功能酶标仪，GENE公司；高速冷冻离心机，科大创新公司；电泳槽、蛋白转印槽、电泳仪，美国Bio-rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠小胶质细胞系BV-2的培养
细胞培养使用的玻璃器皿及器械（培养瓶，移液管等），经过120℃高压灭菌35 min。以IMDM培养基作为基础配制成内含5%胎牛血清及50 μg/ml 2-巯基乙醇的细胞培养液。BV-2小胶质细胞以约4× 105 cells /ml在5% CO2，37℃培养瓶中传代培养，至贴壁细胞约占培养瓶底面积50%～60%，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶，选择第3-8代BV-2细胞进行实验。
1.3.2 药物配制方法
人参三肽均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100 mM，储存于-20℃。临用时用IMDM培养液将其进行稀释，依次稀释为0.1、1、10、100 μM。DMSO终浓度< 1‰。
1.3.3 小胶质细胞NO释放的测定
应用Griess分析法检测细胞中亚硝酸盐水平。取对数生长期的BV-2小胶质细胞，细胞密度调至5×105 cells/ml，接种于96孔板内，100 μl/well。细胞贴壁培养24 h后换成无血清的培养液，进行加药处理。人参三肽设剂量0.1、1、10、100 μM与LPS共同作用。LPS终浓度为100 ng/ml。细胞加药后继续培养24 h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO2-含量。
1.3.4 细胞存活率的测定
采用 MTT 法测定。取对数生长期培养的BV-2小胶质细胞，用含5%胎牛血清的新鲜IMDM培养基将细胞密度调至5×105 cells/ml，接种于96孔板内，100 μl/well，人参三肽设剂量0.1、1、10、100 μM与LPS共同作用，各给药组中LPS浓度同上。细胞加药后继续培养24 h加入MTT溶液，10 μl/well，将细胞与0.25 mg/ml MTT于37℃下共同孵育3 h，吸除培养液，加入100μl的DMSO溶液，测定其光密度OD值。
1.3.5 酶联免疫法测TNF-α
取指数生长期的BV-2细胞配制成细胞悬液， 待细胞贴壁后， 加入各浓度药物预孵育1.5 h后加入1 μg/mL LPS 24 h后检测TNF-α的表达量，按照ELISA试剂盒说明书操作，于450nm 处测OD值，通过绘制标准曲线求出最终浓度。
1.3.6 MDA含量和SOD活性的测定
取对数生长期的细胞，细胞密度调至 5×105 个/m L，细胞贴壁24 h后换成无血清的新鲜培养液，加药后，以 PBS 洗2次，裂解细胞后，11000 rpm /min、5℃离心10min。以紫外分光光度计测定蛋白浓度，按照试剂盒操作说明测定MDA含量和SOD活性。
1.3.7 统计方法
全部数据采用SPSS（17.0）统计软件进行分析。结果用平均值±标准误表示，评价组间整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA，并结合Dunnett’s test分析。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，采用Dunnett’s双侧T检验；当p<0.05，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。
2 实验结果
2.1 人参三肽对LPS活化的BV-2小胶质细胞存活率的影响
实验结果显示，人参三肽（0.1， 1， 10， 100 μM）均不降低细胞存活率，对LPS活化的BV-2细胞存活率也无显著性影响（见图1）。
图l 人参三肽（PGP3）对BV-2小胶质细胞成活率的影响
（A）人参三肽对BV-2细胞存活率的影响
（B）人参三肽对LPS激活的BV-2小胶质细胞存活率的影响
2.2 人参三肽对LPS激活BV-2小胶质细胞NO和TNF-α释放的影响
实验结果（图2）显示，人参三肽（10， 100 μM）作用24 h后能够显著抑制LPS活化的小胶质细胞株BV-2的NO释放（P<0.001）， 低剂量的人参三肽无显著性作用（见图2A）；人参三肽（1，10 μM）能够降低LPS诱导的TNF-α水平的增加（P<0.05）。阳性药米诺环素对NO和TNF-α均有显著的抑制作用。
2.3 人参三肽对活化的小胶质细胞SOD和MDA的影响
实验结果（图3）显示，人参三肽（10，100 μM）降低LPS诱导的MDA增加，而小剂量无显著性作用；大剂量的人参三肽能够增高SOD活性。提示人参三肽可能具有抗氧化能力。
图3 人参三肽（PGP3）对LPS诱导的MDA和SOD释放的影响
（A）人参三肽对MDA含量的影响
（B）人参三肽对SOD水平的影响
与正常对照组比较： #P<0.05；与LPS组比较：*P<0.05
5 讨论
人参三肽是采用现代工艺从中药人参中提取的，首次明确一级结构的人参小分子肽，其保护小胶质细胞炎症的作用未见报道。本实验结果表明，人参三肽能够抑制LPS刺激的BV-2小胶质细胞NO和TNF-α释放的作用，可能与其抗氧化能力有关。
脂多糖（LPS）作为一种细菌内毒素，是较强的致炎剂，可以诱导小胶质的炎症反应，是典型的神经炎症的病理模型，其特征为激活的小胶质细胞释放一氧化氮（NO）、TNF-α、白细胞介素等炎症介质。本研究中，发现人参三肽在不影响细胞存活率的情况下，能够抑制LPS诱导的小胶质细胞释放NO和TNF-α，且能够翻转SOD和MDA的水平，提示人参三肽可能具有抗神经炎症的作用，可能与其抗氧化能力有关。
人参三肽可能具有抗神经炎症、抗氧化能力，其对神经退行性病变可能是一种有效的治疗药物，本研究为人参的进一步深度开发提供理论依据。
参考文献
[1]李红艳. 人参蛋白活性研究[D].长春中医药大学，2010.
[2]王逸，鲍勇刚，贾韦国，刘新民. 人参蛋白研究进展[J]. 中草药，2013（19）：2782-2786.
[3]王颖，陈英红，罗浩铭，姜瑞芝，姜翔之. 人参三肽的序列分析[J]. 吉林大学学报（理学版），2014（04）：852-854.
[4]耿战辉，程义勇. 重新认识神经胶质细胞[J]. 生理科学进展，2003（03）：231-234.