[摘要] 目的 探讨外周血CK-19 mRNA表达与乳腺癌的关系,评价其在乳腺癌诊断上的价值。方法 应用RT-PCR技术检测200例乳腺癌患者外周血中CK-19 mRNA表达情况,并以66例乳腺良性疾病和60例正常健康女性作为对照。结果 200例乳腺癌患者48例外周血CK-19为阳性,66例乳腺良性疾病患者中3例阳性,而同时检查的60位健康者,他们的外周血CK-19均为阴性;不同年龄病人的CK-19检测阳性率对比,彼此之间差异无统计学意义;肿瘤不同分期CK-19阳性率对比差异有统计学意义。结论 RT-PCR法检测CK-19 mRNA可作为乳腺癌诊断的指标。
[关键词] 乳腺癌; CK-19 mRNA; 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2009)33-15-02
Clinical Significance of CK-19 mRNA in Patients with Breast Cancer
MENG Fanjie WANG Yufang WANG Guofeng
Yidu Central Hospital of Weifang City,Qingzhou 262500,China
[Abstract] ObjectiveTo investigate the clinical significance of CK-19 mRNA in patients with breast cancer. MethodsThe CK-19 mRNA expression in the peripheral blood of 20 cases of breast cancer was measured by using RT-PCR method before operation,and 66 patients with benign breast diseases and 60 healthy women were taken as controls. ResultsThe positive rates of CK-19 mRNA in patients with breast cancer and benign breast diseases were 24%(48/200)and 4.54%(3/66),respectively,and CK-19 mRNA was all negative in the 60 healthy women. Thepositive rate difference between the breast cancer group and the control group was significant(P<0.01). There was no difference in the positive rate of CK-19 mRNA in patients of all ages. The positive rates at 0～I,II and III stages were 15.38%(8/52),20%(24/120)and 57.14%(16/28),respectively. There was a significant difference in the positive rate between stage III and stages of 0～I and II(P<0.05). ConclusionCK-19 mRNA can be used as a molecular marker in the peripheral blood by method of RT-PCR for the detection of breast cancer.
[Key words]Breast cancer; Cytokeratin-19 mRNA; RT-PCR
乳腺癌是一种全身性疾病,在疾病早期肿瘤细胞就可能经血液播散出现远处转移[1]。乳腺癌细胞为上皮来源的细胞,而外周血中主要是内皮细胞,而并没有上皮成分,因此乳腺癌患者如果外周血中存在肿瘤细胞,则其血液中会出现上皮细胞或上皮细胞脱落的组织成分。
本文通过RT-PCR方法检测乳腺癌患者外周血CK-19 mRNA表达,研究外周血CK-19 mRNA表达与乳腺癌的关系,并探讨其临床意义。
1 材料与方法
1.1 一般资料
为我院2006年8月至2008年7月女性乳腺癌手术患者200例共200侧,年龄35～78岁,平均年龄49.2岁,左侧96例,右侧104例,按照外科学第6版AJCC乳腺癌TNM分期,T0～T1期52例,T2期120例,T3期28例,同时以同期我院66例良性乳腺疾病患者和60例正常健康女性为对照,所有入选者手术前均未接受任何特殊治疗。
1.1.1 引物 由生工公司提供:
引物序列
A(sense): 5-AAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGC-3’;
B(antisense):5-TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC-3’;
C(sense):5-TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC-3’;
D(antisense):5-CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3’。
1.1.2 试剂 淋巴细胞分离液购自Qiagen公司;RNA抽提试剂盒PCR试剂盒购及自达安基因诊断有限公司;SuperscriptⅡ购自Introvigen公司;Progesterone Receptor购自Antibody Diagnostia公司。
1.1.3 实验器材 美国PE5700荧光定量扩增仪
1.2 方法
对所有的研究对象包括乳腺癌患者和正常人以及乳腺良性疾病患者均抽取检查者5mL静脉血,为防止表皮细胞干扰,第一管1mL均弃用,换注射管后再抽5mL血,置入抗凝管,摇匀并除外溶血标本。取血标本加入淋巴细胞分离液放入15mL离心管,冰孵10~15min期间混匀二次,用冰冻离心机离心,弃去上清,再加入淋巴细胞分离液重复上述操作弃去上清后得到单核细胞。再用RNA抽提盒按说明书步骤进行操作提取mRNA。提取的mRNA用0.5%琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像系统观察,如存在18S、28S条带说明提取mRNA成功。然后,在提取的mRNA中加入PCR试剂盒内的试剂,并加入引物A和引物B,反应体系为50μL,参照试剂盒说明书进行CK-19mRNA RT-PCR第一次扩增,采用双退火温度,退火温度分别是56℃和72℃,扩增产物为1071bp;取第一次扩增产物进行第二次扩增,退火温度为59℃和72℃,扩增产物为746bp。取反应物5μL进行电泳,电泳条件为1xTBE缓冲液,1.5%琼脂糖凝胶,电压5V,时间30~40min。凝胶成像系统观察,如在540bp处出现清晰条带者可证实RNA无降解且反应体系合适。如反应物在462bp处出现清晰条带则为该标本CK-19mRNA阳性,否则为阴性。统计学分析应用SPSS10.0统计软件包对所有数据进行χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
不同研究对象及乳腺癌不同年龄、不同分期CK-19检测结果见表1。
3 讨论
细胞角蛋白(cytokeratin,CK)是一类细胞结构蛋白的总称,根据相对分子质量、等电点等不同可分为1~20种片段,CK-19是上皮细胞骨架的组成成分,也是上皮来源恶性肿瘤细胞中间丝的组成成分,在正常的外周血、骨髓及淋巴结中无表达,是具有高度组织特异性和在乳腺癌细胞中广泛表达的细胞角蛋白,是检测乳腺癌微转移最有价值的标记物[2,3]。
3.1 检测外周血CK-19的临床意义
通过检测外周血CK-19来判断外周血里是否有上皮细胞或上皮细胞的成分,以判断是否有上皮来源的乳腺肿瘤细胞存在。本次观察的对象中,乳腺癌组与对照组阳性率比较有显著性差异(<0.01),因此,从本实验的研究结果来看,用RT-PCR的方法检测外周血CK-19协助诊断乳腺癌其特异性还是很高的。但也发现乳腺良性疾病组CK-19mRNA假阳性率达4.54%,有研究报道,造成假阳性表达的原因可能有上皮细胞的污染、假基因的干扰、外周血中CK-19mRNA的低水平表达等[4]。
3.2 外周血CK-19的阳性率与乳腺癌的多因素分析
目前研究发现,乳腺癌的预后的好坏由多种因素决定的,包括患者的年龄、肿瘤的分期等。本研究探讨乳腺癌患者外周血CK-19阳性与这些预后因素间有否联系。近来,研究发现乳腺癌在女性40~50岁以及60~70岁有两个高发年龄段,而在本研究中发现<40岁、40~50岁、50~60岁以及>60岁的CK-19阳性率相似,他们之间并无统计学差异。因此,CK-19的阳性率与年龄无关。
乳腺肿瘤的大小是乳腺癌分期的一个重要的指标,也是决定乳腺癌预后的因素之一。根据世界卫生组织(WHO)1997年乳腺癌分期:导管内癌或湿疹样癌为Tis,肿瘤<2cm为T1期,2cm<肿瘤<5cm为T2期,肿瘤>5cm为T3期,肿瘤侵犯皮肤或胸壁为T4期。本研究发现T1、T2期乳腺癌的CK-19阳性率无统计学意义,而T3的阳性率明显高于前两期,有统计学意义。由此说明随着肿瘤数目的增多及体积的增大,其血行转移的可能性就增加,特别是肿瘤大于5cm后,血行转移明显增加。同时也说明无论肿瘤有多大,都有可能出现血行播散(由于本研究中仅有4例导管内癌,尚无法证明Tis的肿瘤是否会存在血行播散的可能,这还有待更多的病例进行进一步的研究,从而也说明了为何仍有部分早期的乳腺癌病人会出现远处转移。
[参考文献]
[1] Grunewald K,Haun M,Urbanek M,et al. Mammaglobin gene expression:a superior marker of breast cancer cells in peripheral blood in comparison to epidermal-growth-factor receptor and cytokeratin-19[J]. Lab Invest,2000,80(7):1071-1077.
[2] Schoenfeld A,Kruger KH,CommJ,et al. The detection of micrometastasis in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemistry and reverse transcriptase polymerase chain reaction for keratin 19[J]. Eur J Cancer,1997,33(6):854-861.
[3] Zhang J,Shen K W,Liu G,et al. Antigenic profiles of disseminated breast tumor cells and microenvironment in bone marrow[J]. Eur J Surg Oncol,2003,29(2):121-126.
[4] Ko Y,Grunewald E,Totzke G,et al. High percentage of false-positive results of cytokeratin 19 RT-PCR in blood:a model for the analysis of illegitimate gene expression[J]. Oncology,2000,59(1):81-88.
(收稿日期:2009-02-23)