摘要：以显微注射的方法，将去掉原核DNA的PcDNA3.1IGFTREtrTA诱导型IGF-1载体注射到猪受精卵原核中，经胚胎移植、怀孕、产仔、取样、检测等过程，得到幼仔85头，其中的11头为PCR检测阳性，进一步的Southern blot 检测有10头阳性，即构建的原代诱导型IGF-1转基因猪有10头。
关键词：诱导型；IGF-1；转基因猪
中图分类号：S828.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5077-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.038
Transgenic Pig Construction of the Inducible IGF-1 Model
LIU Xi-mei， HUA Zai-dong， LI Li， ZHANG Li-ping， XIAO Hong-wei， REN Hong-yan， BI Yan-zhen
（Hubei Academy of Agriculture Science/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）
Abstract：In this study， the pcDNA3.1IGFTREtrTA induced IGF-1 vector without prokaryotic DNA was microinjected into pronucleus of pig fertilized eggs. Through embryo transfer， pregnancy， parturition， sampling and testing procedures， 85 little life born， of which 11 was tested positive for PCR， 10 positive for Southern blot detection. It indicated that there had 10 primary transgenic pigs of inducible IGF-1 in the test.
Key words：inducible； IGF-1； transgenic pig
转基因技术应用于动物遗传育种能大大加快遗传改良的进展，具有传统遗传育种所不具有的优势。随着转基因技术的进步，转移至细胞和动物体内的外源基因的不可调控性正逐渐被克服。诱导转基因使转基因技术有了革新性的发展，使人们有了一个更灵活的对遗传时空调控的开关，可以帮助人们弄清楚基因在疾病或发育过程中的作用、发挥作用的关键时期以及其他精确的信息。诱导转基因作为一个理想的遗传开关应该具备以下几个条件：①当其关闭时，本底表达为零，当其打开时应能使转基因高表达；②这个开关是可逆的，在发育或出生后的任何时间，能快速而且可逆地控制转基因的表达；③对其所控制的靶基因是特异的；④不被细胞内其他物质所干扰；⑤不影响细胞内的基本代谢反应。条件转基因体系的出现对于研究基因功能以及动物模型发育期间基因表达的分析有着重大的意义[1]。近年来人工合成的可调控基因表达系统的应用较为广泛，这些基因表达调控系统在组成和结构上有所不同，但基本都包括三个组成部分，即调控部分、携带目的基因的反应部分和诱导因子部分，目标是在细胞或动物整体水平实现对外源基因表达的时空调控，其中Gossen等[2，3]建立的四环素调控系统即Tet—off/Tet—on系统是较完善的最具代表性的基因表达调控系统之一，目前已成功地用于转基因动物模型的研究[4]。胰岛素样生长因子1（IGF-1）是动物生长发育的重要因子之一。不同品种和不同性别猪发育过程中血液的IGF-I水平变化趋势基本一致，即胚胎期低，出生后高。胚胎期随胚龄的增加，IGF-I水平升高。出生后随年龄、体重的增加，IGF-I水平也上升，但不同性别和品种猪血液中IGF-I水平还是有很大差别的。胎儿期，瘦肉型猪肝脏中IGF-I水平高于脂肪型猪。研究发现，出生第一天血液中IGF-I水平瘦肉型猪高于脂肪型猪，3～5月龄的IGF-I上升幅度瘦肉型猪也高于脂肪型猪。对性别差异的研究发现，妊娠 94～98 d雄性胎儿的IGF-I水平高于雌性，出生后差异仍然存在，在3～18月龄雄性猪血液中IGF-I水平要比雌性升高得快。对大白猪的研究也发现，45日龄后大白猪母猪的 IGF-I水平比大白猪公猪低[5-7]。本试验通过构建诱导型IGF-1转基因猪，用转基因技术提高IGF-1的表达，为进一步探索IGF-1在提高生产性能方面的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 诱导型猪IGF-1基因 动物胚胎及分子育种湖北省重点实验室构建保存[8.9]，结构见图1。
1.1.2 试验动物 湖北白猪11～12月龄的后备母猪。
1.1.3 试剂药品 HCG、PMSG，宁波激素二厂；青霉素、链霉素、麻药（氯胺酮、戊巴比妥钠）、磺胺粉等购于湖北省医药公司；地高辛试剂盒，罗氏公司；其他试剂均来源于GIBC公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫 试验猪按照后备猪免疫程序进行免疫。
1.2.2 超排 在发情前4～5 d，按1 000 IU/头注射PMSG；发情前1 d，按1 000 IU/头注射HCG[10]。
1.2.3 配种 观察到开始发情时计，推迟半天进行配种，本交或人工授精均可，每隔8～12 h配一次，共配3次。
1.2.4 手术收集胚胎 用戊巴比妥钠按20～30 mg/kg体重麻醉试验猪，仰卧保定，手术部位为沿腹中线倒数第2、3个乳头之间，清理、消毒创部，尽量避开血管，沿腹中线切开皮肤5～8 cm，分离脂肪、肌肉、腹膜层，轻轻牵出输卵管，在输卵管伞部一侧插入一根直径约3 mm的引导收集管，用大拇指和食指固定，游离端接表面皿，在宫管结合部将针头朝输卵管方向插入，用注射器快速注入37 ℃ PBS液，PBS液沿宫管结合部经输卵管携带着胚胎流至表面皿，胚胎悬浮于PBS液体中。再换另一侧输卵管同样操作冲出胚胎。在实体显微镜下，分拣正常发育的1～2级细胞胚胎（卵）备用[10]。
1.2.5 胚胎离心及显微注射 用移卵管将正常的卵移入1.5 mL透明的离心管内，以15 000 r/min离心3～5 min。离心时间依据卵的实际情况而定。先在凹玻片的中央滴一滴20～30 μL PBS液，覆以石蜡油，然后将离心后的受精卵5～6枚移至液滴中，置于倒置显微镜下，每个细胞核注入DNA的剂量约2 PL（约含300～600个基因拷贝）。
1.2.6 转基因胚胎移植 受体按供体的手术方法，麻醉、保定、切口，引出输卵管，将吸有胚胎的移卵管（采用三段式，即气泡-胚胎-气泡）从输卵管伞口插入输卵管至壶腹部，然后把移卵管内的胚胎和培养液吹入输卵管内。移植完毕，小心将移卵管退出，复原输卵管伞。移卵之后的移卵管吸取PBS，置于实体显微镜下，检查有无余卵。若发现有未移入卵，要重复上述步骤，移到另外一侧输卵管。确信管内无余卵后，即可将卵巢 、输卵管或子宫角清洗，送入腹腔，缝合术部，创口内撒磺胺，外涂碘酊，腹腔注射抗生素。观察受体怀孕情况，等待产仔[11]。
1.2.7 取样检测 受体怀孕足月产仔，在给幼仔剪耳号的同时，收集耳组织样，用DNA提取试剂盒提取DNA。PCR检测引物F：5′-CCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATAT-3′，R：5′-CGATAAGCCA
GTAAGCAGTGGGTTC-3′。反应体系为：样品模板DNA 5μL，10 ×Buffer （含15 mmol/L MgCl2） 2.5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 3 μL，10 μmol/L F1 2 μL，10 μmol/L R1 2μL，Taq DNA 聚合酶1 μL（1 U/μL），加去离子水至25 μL 。扩增反应程序：94 ℃变性3 min ；94 ℃变性55 s ，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s ，35个循环；72 ℃延伸10 min。Southern检测探针为跨IGF1-TRE-rtTA载体上的一段2.0 kb DNA片段，按地高辛检测试剂盒说明书进行Southern检测操作。
2 结果与分析
2.1 转基因胚胎移植及产仔
此次试验共移植受体母猪26头，移入显微注射胚514枚，其中一细胞期胚胎426枚，占82.7%。16头受体产仔，受胎产仔率61.5%（16/26）；共产仔85头，怀孕受体头均产仔数5.3头。其中活仔78头（♂43头，♀35头），活仔率91.8%（78/85）；死胎7头，死胎率8.2%。这一转基因胚胎移植效率及产仔数与魏庆信等[12]的结果相似，说明诱导型IGF-1基因对胚胎及胎儿发育影响不明显，即受胎产仔率、产仔数、活仔率、死胎率等与相关报道结果基本一致[11.13]。
2.2 PCR检测仔猪
受体产下的小猪，取剪耳号的组织块少许（100 mg），提取组织DNA，以此为模板进行PCR反应，取扩增产物8 μL，用1%琼脂糖凝胶、1×TAE 缓冲液、75 V 电压电泳40 min ，在紫外灯下观察扩增情况。每个样品重复3 次PCR反应。扩增产物电泳后，在紫外灯下观察到一条1.3 kb目的扩增片段的样品即为转pcDNA3.1-IGF1-TRE-rtTA基因阳性猪。在85头仔猪样品中，有11头样品得到与阳性对照一样大小的电泳带（图2），确定为PCR阳性猪。
2.3 Southern检测
对PCR阳性样品做进一步检查，即Southern杂交，结果除7号样品没有显示与阳性对照大小一致的杂交带外，1、2、3、4、5、6、8、9、10、11样品均有杂交带（图3），表明有10个样品带有诱导型IGF-1基因，它们对应的仔猪编号见表1，即有10头转诱导型IGF-1基因仔猪。两种检测结果完全相符，确认表1所列10头猪为阳性的转IGF-1基因猪。
3 讨论
3.1 转基因方法
动物转基因的方法比较多，包括显微注射法、病毒感染法、精子载体法、电转法、脂质体法、体细胞克隆法等，其中显微注射法是一种传统的、稳定的体系，最为关键的是它能做到制备无标记、稳定遗传的动物，尤其是当今的基因编辑技术，利用显微注射可以实现基因组编辑，而且不带任何标记，其他方法要生产既无标记又能稳定遗传的动物就特别困难[11，14]，本试验用显微注射制备诱导型IGF-1转基因猪过程中，载体上去掉了原核骨架，仅保留有效的表达结构部分重组DNA，这一诱导型结构在需要表达的阶段，饲以诱导剂（四环素或强力霉素），促进表达，改变猪的生产性能，这种猪的构建为进一步育种工作奠定了基础。
3.2 转基因检测
在转基因动物研究中，为了简化检测程序，在对目的基因表达载体设计时，常常采用可以直观分辨转基因个体的元素，常用的有毛色、肤色、发光、药物刺激表象、动作特征等。如能够表达黑色标记的个体，在白色群体中黑色个体为阳性转基因猪；带有荧光（GFP、RFP等）标记的转基因个体，在激发光刺激下会发出相应的荧光等；而药物刺激表象、动作特征类型的转基因动物仅有转基因鼠个体出世[15]。这类转基因动物检测比较容易，不需要试剂、药品和专门的仪器设备，仔猪一出生就能很快鉴别，但在构建表达载体时，需要设计特别的标记基因。而本试验考虑到将来IGF-1转基因猪育种问题，不宜带特别的标记基因，这就需要做分子生物学检测—PCR及Southern检测，其中PCR检测快速、敏感，但易受采样、试验环境、操作过程等因素的影响而导致假阳性，因此，每个样品要重复多次，即便是这样还是不能保证阳性的正确性，只有做进一步的Southern检测。Southern检测过程复杂，敏感性低，正确性高，一般重复一次即可，而且重复性比较好。不过对原代转基因猪而言，用基因组DNA检测很容易漏检，所以改用PCR样品的Southern检测，获得整合目的基因的IGF-1转基因。就诱导型转基因猪检测还可以考虑结构基因中不同片段的检测，以便从不同的角度进行检测，作为进一步的佐证来提高检测的准确性[9.16]。
3.3 转基因效率
应用原核注射法制备转基因猪的效率在0.31%～4.00%之间，平均效率为1.10%。在同一实验室的趋势是后期的效率比前期的高。这不难理解，前期还处于摸索技术、建立方法的过程中，而后期技术趋于成熟、诸多环节得到改进、操作逐渐熟练、效率也随之逐步提高。国内有部分转基因猪试验平均效率达到2.4%，这与自体移植技术的应用不无关系[11]。除技术层面之外，转基因的效率还与外源基因有关，如外源基因过表达、目的基因表达产物有毒副作用（致胚胎、胎儿死亡或畸形等）、外源基因整合位点效应等都会影响转基因效率[12]。
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