水稻OsLecRK基因RNAi载体的构建及遗传转化

基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品种 供试水稻品种为合江19，购自国家种质资源库，以下简称H1493。

1.1.2 质粒与菌种 大肠杆菌（E. coli）DH5α和农杆菌EHA105。所使用的载体包括pCAMBIA1301载体、pCU载体和pKANNIBAL载体，载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 工具酶及主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、pMD19-T 载体、T4 连接酶购自于宝生物工程（大连）有限公司。试剂：蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素购自于Sigama公司；Taq DNA polymerase、pfu DNA polymerase、dNTPs、DNA凝胶回收试剂盒等购自康为世纪生物科技（北京）有限公司；质粒小量快速提取试剂盒、核酸分子量 Marker 购自天根生化科技（北京）有限公司； 其余常规药品均为进口或国产分析纯。引物合成和测序由北京奥科生物技术有限公司完成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获得 采用小量DNA提取方法提取水稻品种B5基因组 DNA。以B5基因组 DNA 为模板，OsLecRKXE和OsLecRKXH为引物，分别扩增两段OsLecRK 基因530 bp的顺式和反式片段。PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，上、下游引物（10 μmol /L）各 0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。将其PCR产物分别进行回收，回收片段经加尾 polyA后与克隆载体 pMD19- T载体连接，构建重组质粒，然后将其转化大肠杆菌DH5α。

1.2.2 RNAi重组载体的获得 扩增靶标片段连入pMD-19T载体测序正确后，从pMD19-T载体上使用XhoⅠ+EcoRⅠ双酶切切下顺向靶标片段（OsLecRK）并连入pKANNIBAL载体，构成载体pKAN- OsLecRK XE。同样从pMD19-T载体上使用XbaⅠ+HindⅢ双酶切切下反向靶标片段OsLecRK连入载体pKAN-OsLecRK XE，构成重组载体pKAN-（OsLecRK）2。目的片段以相反的方向克隆到pKANNIBAL载体的两个多克隆位点接头中，中间被Pdk内含子隔开，即形成dsRNAi片段。最后利用BamHⅠ酶切载体pKAN-（OsLecRK）2得到所需的dsRNAi片段，连入经BamHⅠ酶切的pUC载体，构成RNAi载体。

1.2.3 转基因水稻的获得鉴定 将构建好的重组质粒转化农杆菌EHA105，在含有50 μg/μL卡那霉素和50 μg/μL利福平的平板培养基上筛选，单菌落以OsLecRKXE为引物进行PCR鉴定。将鉴定正确的单菌落进行摇菌，待菌液为OD600 nm约0.5时，侵染预先培养好的日本晴愈伤组织，28 ℃暗培育2.5 d；将愈伤组织挑出放入无菌三角瓶中，用含500 mg/L头孢拉定的无菌水清洗干净；晾干后放入含500 mg/L潮霉素培养基上筛选15 d，共筛选2次；将培养基上能增生分裂的抗性愈伤组织转入分化培育基上，一周后愈伤组织开始转绿；将其转到装有分化培育基的三角瓶中，约3周后，愈伤组织长出嫩芽并生根；待根部发育粗壮、苗高约6～10 cm时，打开瓶盖进行炼苗；一周后移栽大田。

1.2.4 转基因水稻的鉴定 提取水稻的总DNA，具体步骤按试剂盒说明操作。以Hyg-F/Hyg-R为引物对进行抗性基因检测，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL， MgCl2（25 mmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，上、下游引物（10 μmol /L） 各0.5 μL，质粒1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 RNAi干扰片段的克隆

以模式抗虫水稻品种B5 mRNA为模板，采用RT-PCR 扩增（NCBI accession number：Os04g 12560）

靠近翻译起始位点ATG带有特定限制性酶切位点的530 bp长的正反义片段，结果与预期片段大小相符（图1）。

2.2 OsLecRK RNAi载体的构建

分别选择OsLecRK基因编码区的530 bp作为该基因的目的片段，用于构建RNAi载体转化水稻。OsLecRK使用正向引物带有XhoⅠ+BamHⅠ酶切位点和反向引物带有EcoRⅠ酶切位点扩增靶标片段，连入pMD19-T载体测序正确后，从pMD19-T载体上使用XhoⅠ+EcoRⅠ双酶切切下靶标片段OsLecRK并连入pKANNIBAL载体，构成载体pKAN-OsLecRKXE（图2）。

然后再使用正向引物带有XhaⅠ+BamHⅠ酶切位点和反向引物带有Hind III酶切位点扩增靶标片段，pMD19-T载体测序正确后，从pMD-19T载体上使用XbaⅠ+Hind Ⅲ双酶切切下靶标片段OsLecRK连入载体pKAN-OsLecRKXE，构成载体pKAN-（OsLecRK）2（图3）。

目的片段以相反的方向克隆到pKANNIBAL载体的两个多克隆位点接头中，中间被Pdk内含子隔开，获得pKAN-OsLecRK-RNAi的中间表达载体。使用BamHⅠ酶切载体pKAN-（OsLecRK）2，得到dsRNAi片段，连入经BamHⅠ酶切的pCU载体，构成RNAi载体（OsLecRK-RNAi）（图4）。

2.3 转基因植株的获得

利用农杆菌介导的遗传转化方法，将构建好的RNAi载体（OsLecRK-RNAi）利用电转化的方法导入农杆菌菌株EHA105中，以粳稻品种合江19为受体进行遗传转化水稻。以靶标基因和潮霉素设计引物，通过PCR进行鉴定OsLecRK-RNAi（图5），获得OsLecRK-RNAi阳性转化植株。

3 小结与讨论

RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术是反向遗传学重要的试验技术手段之一，具有特异性和高效性，是研究基因功能的有效途径之一[6]，它的应用为阐明基因生物学功能提供了有利的工具。相关研究表明，有效的靶基因片段对 RNA干扰的成功非常重要，基因片段长度在 23～1 000 bp间都能获得良好的沉默效果[7]。

为了研究和验证OsLecRK基因的生物学功能，通过反向遗传学的方法，敲除水稻OslecRK基因，构建了RNAi抑制转基因株系，为进一步研究奠定基础。

参考文献：

[1] KHUSH G S. Origin，dispersal，cultivation and variation of rice[J].Plant Mol Biol，1997，35（1-2）： 25-34.

[2] WAN J， PATEL A， MATHIEU M，et al. A lectin receptor-like kinase is required for pollen development in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology，2008，67： 469-482.

[3] CHEN X，SHANG J，CHEN D，et al. A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance[J]. The Plant Journal， 2006， 46：794-804.

[4] XIN Z，WANG A，YANG G，et al. The Arabidopsis A4 subfamily of lectin receptor kinases negatively regulates abscisic acid response in seed germination[J]. Plant Physiology， 2009，149：434-444.

[5] DENG K，WANG Q，ZENG J，et al. A lectin receptor kinase positively regulates ABA response during seed germination and is involved in salt and osmotic stress response[J]. Journal of Plant Biology， 2009， 52：493-500.

[6] MIKI D， ITOH R， SHIMAMOTO K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J]. Plant Physiology， 2005， 138（4）： 1903-1913.

[7] WESLEY S V， HELLIWELL C A， SMITH N A ，et al. Construct design for efficient， effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. Plant Journal， 2001， 27（6）：581-590.

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