Hh sM<ض0!B0NJZr+]<>E%M!3@M!3@Px饃+"http://www.51feid.com/keys/kaifang.html" target="_blank" class="keylink">开放阅读框（open reading frame，ORF）和一个小的开放阅读框pipo（Pretty Interesting Potyviridae ORF）。大的开放阅读框编码的多聚蛋白（Polyprotein）通过自身编码的蛋白酶进行自身切割加工，从而产生多个成熟的蛋白，从 N 端到 C 端依次为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、 NIa、NIb和外壳蛋白 CP[1]。NIa是马铃薯Y病毒属病毒RNA编码的一个重要的非结构蛋白，由2个结构域组成，即N端的VPg 结构域和C端的NIa-Pro结构域。由于VPg 结构域含有核定位信号，NIa累积在寄主细胞核内可形成内涵体[2]。研究发现在感病的宿主细胞中，NIa-Pro也以有限数量的自由态游离于细胞质中，是由很小一部分的NIa蛋白通过顺式识别自身的酶切位点剪切VPg 结构域，从而脱离了核定位信号的束缚，并扩散在寄主细胞胞质中[3]。NIa-Pro能够以顺反2种方式识别病毒多聚蛋白上的7个蛋白切割位点，在病毒生活史的各个环节中发挥重要的功能[1]。除了作为蛋白酶，NIa-Pro还可积聚在病毒感染后期的细胞核中，表现出DNA酶的活性以降解寄主DNA[4]。另外，NIa-Pro在被侵染的宿主细胞质中表现出非特异性的RNA 结合功能，这说明NIa-Pro可能在病毒入侵过程中参与了病毒的复制过程[5]。此外，马铃薯Y病毒PVY的NIa-Pro 能够诱导Ry介导的宿主抗性[6]。最近研究还表明，芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的NIa-Pro可通过调节植物的生理功能来促进蚜虫对病毒的传播[7]。番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是限制当前重要的热带水果番木瓜（Carica papaya L.）种植业发展的最为严重的病害[8]。研究发现，PRSV NIa-Pro上第27位亮氨酸决定了PRSV P型和W型的宿主范围特异性[9]。NIa-Pro作为重要的多功能蛋白，需要和一些宿主蛋白相互作用来发挥其功能，本课题组从番木瓜cDNA文库中筛选出6个与NIa-Pro互作的候选寄主蛋白[10]。以上这些研究表明，NIa-Pro参与病毒复制、宿主防御等过程，并且具有宿主专一性，在病毒侵染和植物防御过程中起着重要作用。
外源表达NIa-Pro不仅可以用于研究NIa-Pro在病毒侵染中的功能，还可以在基因工程领域将其用于切除重组蛋白的融合标签。目前已有报道称，利用原核表达系统对6种马铃薯病Y毒属病毒的NIa-Pro进行了外源表达，分别是芜菁花叶病毒（turnip mosaicvirus，TuMV）[11]、烟草脉斑驳病毒 （Tobacco vein mottling virus，TVMV）[12]、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）[13]、李痘病毒（Plum pox virus，PPV）[14]、辣椒脉带病毒（Pepper vein banding virus，PVBV）[15]、豆蔻花叶病毒（Cardamom mosaic virus，CdMV）[16]等。而关于PRSV NIa-Pro外源表达的研究还未见报道。本研究通过原核表达系统成功表达并经纯化获得了有核酸酶活性和具特异性识别位点（THVFHQ/S）[17]的蛋白酶活性的PRSV NIa-Pro，为进一步探究NIa-Pro在病毒侵染中的功能和进一步将其作为蛋白工具酶进行应用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌感受态trans10、表达菌株[Transetta（DE3）]购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂 PCR 反应所用试剂、T4 DNA 连接酶、DL2000 DNA marker、DL 15 000 DNA marker、 Premixed protrin Maker、4×Loading Buffer购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；IPTG 为美国 Invitrogen 公司产品；限制性内切酶 NcoⅠ、 BamHⅠ（Therom Scientific）、鼠抗6-His-Tag抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG、Easy see Western Marker、HRP-DAB底物显色试剂盒、BCA蛋白质定量试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；HisTrap HP 型 Ni2+亲和柱为 GE Healthcare公司的产品；pMAL protein & Purification system购自NEB公司。
1.1.3 引物设计及合成 根据GenBank的PRSV-HN2序列[18]（GenBank登录号：KF791028）设计引物，用于扩增NIa-pro基因。上游引物（NIa-F）为ATACCATGGGCGGAAAGAGCCTCTGCCAAGGC，下游引物（NIa-R）为GTTGGATCCTTAGTGGTGGTGGT