[摘要] 目的 探讨消瘀泄浊饮对造影剂肾病（CIN）大鼠是否具有保护作用及其相关机制。 方法 将24只雄性SD大鼠随机分为4组：正常组（A组）、CIN组（B组）、消瘀泄浊饮低剂量组（C组）和消瘀泄浊饮高剂量组（D组）。造模后48 h处死大鼠，测定各组大鼠血清肌酐、尿素氮水平，HE和PAS染色观察各组肾脏组织病理变化，Western Blot检测各组Bax、Bcl-2、Caspase-3、P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表达量。 结果 造模48 h后，与A组相比，B组大鼠血清肌酐和尿素氮水平均明显升高（P<0.05）;肾小管上皮细胞出现空泡样变性、管腔变大及肾间质水肿，肾小球组织未发现明显改变;Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表达上调（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表达同时上调（P<0.05）。与B组相比，C、D组血清肌酐和尿素氮水平明显下降（P<0.05）;肾小管上皮空泡样变性减少;Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表达下调（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表达同时下调（P<0.05）。 结论 消瘀泄浊饮对造影剂肾病大鼠具有预防作用，其机制可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路过度激活从而抑制肾小管上皮细胞凋亡。
[关键词] 消瘀泄浊饮;造影剂肾病;凋亡;PI3K/Akt/mTOR信号通路
[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2019）02-0037-04
造影剂肾病（Contrast induced nephropathy，CIN）是指造影剂引起的肾功能急骤下降[1]。随着造影剂在放射学诊断检查和介入手术中的普遍应用，CIN已成为一种临床常见的并发症，CIN发生率在普通人群中为0.6%～2.3%，高危人群中可达90%[2]，是仅次于肾灌注不足和肾毒性药物引起的医院获得性急性肾损伤的第三大常见原因[3]。实际工作中对CIN的认识仍然不够，目前尚无有效措施逆转CIN病程进展，最好的治疗方法就是预防，而在预防CIN发生方面方法不多，目前临床疗效较为肯定的仅有水化。消瘀泄浊饮取自全国名老中医李学铭临床验方，该方在气虚夹瘀浊的慢性肾病患者中已取得良好疗效[4]，本研究希望通过中西医结合手段进一步研究中药方剂在CIN中的应用，明确消瘀泄浊饮对CIN大鼠肾功能的保护作用及探讨其相关机制。
1 材料与方法
1.1 动物和试剂
选择SPF级雄性SD大鼠24只，体重（220±10）g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，动物生产单位为上海西普爾必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。消瘀泄浊饮全方由黄芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龙12 g、制军10 g、车前草20 g 组成，以上中药均由浙江中医药大学附属第二医院中药房提供;吲哚美辛（1 mg/100 g）和 N-硝基-L-精氨酸甲酯（1 mg/100 g）均购自Sigma 公司;复方泛影葡胺注射液（20 mL/12 g）购自西安汉丰药业有限责任公司（国药准字H20034058）。广谱磷酸酶抑制剂混合物（规格：1 mL）和荧光二抗（规格：100 μL）均购自博士德生物工程有限公司;cleaved-Caspase-3抗体、GAPDH抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Akt抗体、P-Akt抗体、mTOR抗体、P-mTOR抗体均购自Cell Signaling Technology公司，规格均为100 μL。于2016年7月～2018年2月进行试验。
1.2 动物造模和分组
随机分为4组，6只/组：正常组（A组）、CIN组（B组）、消瘀泄浊饮低剂量组（C组）和消瘀泄浊饮高剂量组（D组）。其中B、C、D组按照参考文献制备CIN 模型[4]，具体方法如下：大鼠造模前禁水12 h，自由进食。称重后按10%水合氯醛0.32 mL/100 g（购自陕西盘龙医药物流有限公司，规格：500 mL，国药准字H37022673）腹腔注射麻醉。尾静脉注射10 mg/kg吲哚美辛;15 min后注射10 mg/kg L-NAME;15 min后注射2 g/kg的泛影葡胺。A、B组：灌胃等剂量生理盐水。C、D组于造模前1周开始每日灌胃消瘀泄浊饮煎剂，灌胃量分别为成人标准体重（60 kg）常规用量20、50倍。各组均未予水化治疗。
1.3 肾功能和组织形态学检测
1.3.1 肾功能检测 造模后48 h 处死动物，尾静脉采血，分离血清。由全自动生化分析仪测定血清肌酐和尿素氮水平。
1.3.2 HE和PAS染色 取大鼠肾脏组织，经多聚甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制作病理切片，切片厚度4 μm，HE染色和PAS染色后光学显微镜下观察[5，6]。
1.4 Western Blot法检测
取大鼠肾脏组织标本液氮研碎，加入裂解液，经匀浆离心后，取上清液用BCA法测定蛋白浓度，变性后-20℃保存。取各组样本50 μg，进行12% SDS-PAGE并湿转至PVDF膜上，用3% BSA室温摇床封闭2 h，加入3%封闭液稀释的抗体（1：1000稀释），4℃冷库摇床过夜，用TBST洗涤15 min×3次。然后，加入二抗（1：2000稀释），室温下摇床孵育2 h后，用TBST洗涤15 min×3次。ECL发光液显色，胶片扫描后用Imgae J软件进行图像分析，以GAPDH（1：1000稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量[7]。
1.5 统计学分析
所有数据均采用 SPSS 22.0软件统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差进行分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 消瘀泻浊饮对CIN大鼠肾功能的影响
见表1。与A组相比，B组大鼠血清肌酐和尿素氮水平明显升高（P<0.05）;与B组相比，C、D组血清肌酐和尿素氮水平显著下降（P<0.05），且D组较C组肌酐降低更明显（P<0.05），D组较C组尿素氮降低不明显，无统计学差异（P=0.438>0.05）。
表1 各组大鼠肾功能指标比较（x±s，μmol/L）
注：与B组相比，#P<0.05 ;与C组相比，*P<0.05
2.2 HE染色
A组大鼠肾小管、肾小球、肾间质区未见明显异常，B组大鼠可见肾小管上皮细胞空泡样变性，管腔明显扩大，刷状缘部分脱落，间质水肿。C、D组大鼠与B组相比，均能有效减轻大鼠肾小管-间质病变，肾小管上皮细胞空泡样变区域明显减少，且D组较C组明显。见封三图2。
2.3 PAS染色
PAS染色显示：A组肾小球血管袢薄而清晰，较少糖原沉积;与A组相比，B、C、D组肾小球基底膜、系膜均未见明显糖原沉积和增生，各组间未见明显差异。见封三图3。
2.4 Western Blot法检测
Western Blot检测结果显示：与A组相比，B组大鼠肾脏组织Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表达上调（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表达均同时上调（P<0.05）;与B组相比，C、D组Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表达下调（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表达均同时下调（P<0.05）。见图1和表2。
3讨论
造影剂肾病（Contrast-induced nephropathy，CIN）又称造影剂诱导的急性肾损伤，被定义为造影剂暴露后48～72 h后血肌酐绝对值较基础值升高≥0.5 mg/dL（44.2 μmol/L）或相对升高≥25%，并排除其他可能引起肾损伤的原因[8]。虽然大多数CIN患者血肌酐1～4周可恢复正常水平，但仍不能认为CIN发病是一良性的、一过性的肌酐增高。Maioli等[9]研究显示：肾小球滤过率<60 mL/min的PCI患者中CIN的发病率为12.1%，其中18.6%的患者3个月后的肌酐清除率仍较基础值减少25%，急性肾损伤可演变为持续性肾损伤。对比剂对肾脏的毒性包括分子的直接化学毒性（离子性、含碘物质）、渗透毒性及组分中与黏度相关的毒性[10，11]。目前研究认为直接肾小管毒性和氧化应激是造影剂肾病的主要病理生理机制，而细胞凋亡在两者中均发挥着重要的作用[12]。
消瘀泄浊饮由李老自《医林改错》“补阳还五汤”化裁而来。全方由黄芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龙12 g、制军10 g、车前草20 g 组成。大黄为君药，具有通利逐瘀、荡涤胃肠、清除邪浊之功;桃仁、牛膝和地龙具有活血祛瘀之功，共为臣药;生黄芪为佐药，补气行血，加大活血化瘀之功;车前草利水通淋，导浊下行，是为使药[13]。因此消瘀泄浊饮具有排泄造影剂、减少造影剂滞留对肾脏的毒性作用;同时其活血化瘀能改善肾脏血流，减少氧化应激对肾脏的损害。本研究通过复制CIN大鼠模型，结果显示CIN大鼠组（B组）血清肌酐和尿素氮水平明显升高，且出现肾小管上皮细胞空泡样变性，刷状缘部分脱落，间质水肿，说明造影剂肾病大鼠造模成功，与既往研究相符[14]。与模型组相比，消瘀泄浊饮组可减少肾小管上皮细胞空泡样变性和肾间质水肿，降低大鼠血清肌酐和尿素氮水平，从而改善CIN大鼠肾功能。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡[15]，而Bcl-2家族和caspase家族在细胞凋亡转导途径中起着非常重要的调节作用，特别是在线粒体途径中。Bcl-2和bax蛋白位于线粒体上游，是线粒体膜通透性改变的重要调节基因。它们的过表达可以控制上游cyt-c的释放和下游caspase-3蛋白酶的活化并介导细胞凋亡[16]。本研究中，Western Blot检测发现：与模型组相比，消瘀泄浊饮组Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表达下调;说明消瘀泄浊饮可能通过Bcl-2/Bax介导的线粒体凋亡信号传导途径抑制肾小管上皮细胞凋亡。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian aarget of rapamycin，mTOR）是一种进化上相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可受生长因子、营养物质和能量等多因素影响，可通过磷酸化其下游的靶蛋白，参与基因的转录和蛋白的表达，进而影响凋亡等的生物活性[17]。细胞外的生长因子和细胞因子可通过受体酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K催化PIP2转化为PIP3，并在PDK1的协同下磷酸化Akt使其激活。活化的Akt磷酸化TSC2，而被磷酸化的TSC2将从負向调控Rheb活性增强，正向调控mTOR的活性[18]。本研究显示：与模型组相比，消瘀泄浊饮组P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表达下调，提示消瘀泄浊饮组可有效地抑制过度激活的PI3K/Akt/mTOR信号通路。
本研究的局限性：本研究缺乏肾小管上皮细胞实验，未能使用mTOR抑制剂雷帕霉素反证消瘀泄浊饮抑制肾小管上皮细胞凋亡是通过介导PI3K/Akt/mTOR信号通路，且消瘀泄浊饮具有祛瘀、活血化瘀之功效，其对CIN大鼠的保护机制还可能与氧化应激、炎症反应、自噬和细胞存活等通路相关[19-21]。
综上所述，本研究证实：消瘀泄浊饮作为临床上治疗慢性肾病患者的临床验方，其具有通利逐瘀等功效，可有效改善CIN大鼠肾功能，其机制可能是通过抑制过度激活的PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制肾小管上皮细胞凋亡，但还需进一步的实验证实。
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（收稿日期：2018-07-26）