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[摘要] 目的：探讨ERK/FoxO3a信号轴是否介导牡荆脂素（VB-1）对人肝癌HepG2细胞系增殖的抑制作用。方法：MTT法观察不同浓度VB-1对人肝癌HepG2细胞系和永生化人胚肝L-02细胞系增殖的影响，集落形成法检测细胞生长，Western blot检测ERK1/2，FoxO3a蛋白磷酸化水平。结果：VB-1以浓度依赖方式抑制HepG2细胞增殖活性，对L-02细胞作用微弱。VB-1有效抑制HepG2细胞锚定依赖生长，并降低p-ERK1/2，p-FoxO3a表达水平，呈浓度依赖性。MEK抑制剂PD98059增强VB-1抑制HepG2细胞增殖和ERK1/2，FoxO3a磷酸化的作用。结论：VB-1通过阻断ERK/FoxO3a信号轴抑制肝癌HepG2细胞增殖活性。
[关键词] 肝癌；牡荆脂素；VB-1；ERK1/2；FoxO3a
肝癌是位居世界第五位的常见实体肿瘤，病死率位居第三位。肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的80%～90%，预后差，死亡率高[1-2]。HCC 最有效的根治方法为手术切除，但多数患者确诊时已属中晚期。手术术后复发也是需面对的严峻问题，因此药物治疗对肝癌不可或缺。化疗药物会对患者产生毒副作用，且易发生多药耐药。因此研究天然植物抗肿瘤有效成分，开发新型低毒副作用、有效的抗肝癌药物具有重要意义。作者前期研究证实来自黄荆子的乙酸乙酯提取物Evn-50具有广谱抗肿瘤活性，以新木脂素类的牡荆脂素化合物VB-1含量最高并具较强的抗肿瘤活性[3]，据报道其对包括肝癌细胞在内的多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用[3-5]，但作用机制尚不清楚，本研究旨在探讨VB-1是否通过调控ERK/FoxO3a信号通路抑制人肝癌HepG2细胞系细胞增殖活性，为VB-1应用于防治肝癌提供实验依据。
1材料和方法
1.1药品和试剂 人肝癌HepG2细胞系和人胚肝L-02细胞系购自中国典型物培养保藏中心；黄荆子木脂类化合物VB-1[6-羟基-4-（4-羟基-3-甲氧基苯基）3-羟甲基-5-甲氧基-3，4-二氢（3R，4S）-2-醛基萘]由中南大学药学院天然化合物系提供；抗ERK1/2，p-ERK1/2，FoxO3a，p-FoxO3a，β-actin抗体购自美国Cell Signaling公司；DMSO，胰蛋白酶，MTT，5-FU购自美国Sigma公司。
1.2细胞培养和处理 细胞常规培养用DMEM培养基置37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞实验，实验组细胞分别采用含2.5，5.0，10.0 μmol·L-1 VB-1的培养基培养；溶媒对照组细胞采用含0.1%DMSO的培养基培养，在细胞毒性试验中，同时设置阳性对照孔5-FU 10.0 μmol·L-1。
1.3MTT测定 取对数生长期细胞，用无血清DMEM培养基调节细胞密度为以5 000个/孔，并接种于96孔细胞培养板中培养24 h。然后按照前述分组方法处理48 h，加入5 g·L-1 MTT溶液20 μL，继续培养4 h，吸除培养基，加入150 μL DMSO 溶解沉淀的紫蓝色晶体。用ELX-800 酶联免疫检测仪在570 nm波长测定吸光度A。设0.1%DMSO组细胞增殖活性为100%，计算相对细胞活力=A实验组/A对照组×100%。
1.4平皿集落形成试验 取24孔培养板，每处理组的培养体系为单细胞悬液，置37 ℃，5%CO2 24 h，后加入不同浓度VB-1处理，同时设置阳性对照孔5-FU 10.0 μmol·L-1，溶媒对照孔0.1%DMSO，每组3个复孔，48 h后，药物换成新鲜培养液，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液，当培养皿中出现肉眼可见细胞集落时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15 min，弃甲醇后空气干燥。用0.5%结晶紫染液染色10 min，流水缓慢洗去染液，空气干燥。以细胞数大于50个或直径大于75 μm为一个克隆，倒置显微镜下计数每孔克隆数。
1.5Western blot 分析 用或不用PD98059预处理30 min，不同浓度的VB-1处理24 h，裂解细胞。细胞裂解液的蛋白样品（50 μg总蛋白/泳道）经10%SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF膜。分别加入一抗于37 ℃孵育过夜；PBS-T洗膜15 min，4次。辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗与膜孵育1 h，PBS-T洗膜15 min，4次。用增强型化学发光剂检测印迹蛋白。X线胶片扫描后，用图像分析软件（AlphaimagerTM 2200）分析。
1.6统计学处理 实验数据以±s表示，采用SPSS 16.0统计学软件处理。多组比较采用完全随机设计资料的方差分析，两两比较用SNK 法检验，P<0.05为具有统计学意义。相关分析采用直线相关分析方法，计算Pearson相关系数，双侧P<0.05为具有统计意义。
2结果
2.1VB-1对肝癌HepG2细胞增殖的影响 不同浓度VB-1抑制人肝癌HepG2细胞增殖，各组间相比有统计学意义（P<0.05），对永生化人胚肝L-02细胞作用微弱。相关性分析显示浓度与细胞存活率呈负相关，相关系数为-0.96，P=0.04，提示VB-1以浓度依赖方式抑制人肝癌HepG2细胞增殖。在相同药物浓度下，VB-1抑制肝癌细胞增殖作用优于常规化疗药物5-FU，并其选择性较高（图1）。
2.2VB-1对HepG2细胞锚定依赖生长的影响 平皿集落形成实验结果显示， 5.0，10.0 μmol·L-1 VB-1处理的HepG2细胞集落数均显著低于对照组，且随着VB-1浓度的增加，细胞HepG2集落数逐渐减少，VB-1对HepG2细胞生长抑制作用优于同浓度的5-FU（图2）。提示VB-1可以浓度依赖的方式显著抑制HepG2细胞集落形成，对HepG2细胞的锚定依赖性生长有显著抑制作用。
2.3VB-1对HepG2细胞ERK1/2及下游FoxO3a蛋白磷酸化的影响 ERK在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，是多种信号交汇点或共同通路，可磷酸化调控其下游基因FoxO3a[6]。因此检测VB-1对ERK1/2，FoxO3a 的磷酸化水平的影响。不同浓度的VB-1处理HepG2细胞24 h后，Western blot发现VB-1以浓度依赖方式下调ERK1/2及下游FoxO3a蛋白的磷酸化水平，不影响其总蛋白水平，不同浓度组各指标差异具有显著性（P<0.05，图3）。提示VB-1可能通过抑制ERK1/2活性进而减少FoxO3a蛋白磷酸化，激活FoxO3a活性。
2.4抑制ERK1/2对VB-1活化FoxO3a的影响 为了阐明VB-1激活FoxO3a的分子机制，用20 μmol·L-1 PD98059（MEK1/2 抑制剂）预处理HepG2细胞30 min，VB-1 5.0 μmol·L-1作用24 h。发现MEK1/2抑制剂亦能降低HepG2细胞ERK1/2，FoxO3a磷酸化水平，并与VB-1合用具有协同效应（图4）。提示VB-1可通过抑制ERK1/2激活FoxO3a 转录活性。
2.5抑制ERK1/2对VB-1抑制HepG2细胞增殖的影响 为了明确VB-1 是否通过MEK/ERK信号通路而抑制HepG2细胞增殖，用20 μmol·L-1PD98059（MEK1/2 抑制剂）预处理HepG2 30 min，然后用不同浓度VB-1处理48 h。发现MEK1/2 抑制剂处理过后可增强VB-1抑制HepG2细胞增殖的作用（图5）。
3讨论
既往研究已证实木脂素类化合物为一种植物雌激素，具有调节激素平衡、抗氧化、抗肿瘤等作用，且其对肿瘤细胞的影响是多途径、多机制的。VB-1作为一种新木脂素化合物，具较强的抗肿瘤活性，其作用机制涉及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的改变及caspases的活化，Akt-mTOR信号通路的抑制，细胞周期阻滞等[3-5，7]。本研究发现VB-1可通过调节ERK/FoxO3a信号通路抑制肝癌细胞增殖。
MEK/ERK信号通路能被多种生长因子、细胞因子及促分裂剂激活，在细胞增殖、分化、凋亡、代谢中发挥重要作用，在很多肿瘤中发现该通路中蛋白分子表达异常或者突变，包括肝癌，因此参与这一信号通道的分子是肿瘤防治的重要靶标[8]。大量研究表明抑制ERK活化来抑制肿瘤细胞的增殖或转移，在肿瘤治疗中发挥重要作用。FoxO3a是Forkhead家族的一个重要成员，其活性高低、亚细胞定位及参与的信号通路与多种肿瘤发生发展有关[9-10]。它可通过促进凋亡、抑制增殖及控制癌细胞分化、抑制血管生成、调节其他抑癌基因而发挥抑癌作用[7，11-12]，其活性受磷酸化、乙酰化及泛素化等转录后调控。ERK分别磷酸化FoxO3a的Ser294，344和425位点，促进FoxO3a泛素化，导致泛素-蛋白酶体通路介导的FOXO降解，抑制FoxO3a活性[6]。本研究以HepG2细胞系细胞为实验系统，探讨ERK/FoxO3a信号通路在VB-1抑制肝癌细胞增殖中的作用，发现VB-1下调ERK，FoxO3a的磷酸化水平，呈浓度依赖性激活FoxO3a，应用特异性MEK1/2抑制剂预处理HepG2细胞则能增强VB-1诱导的FoxO3a活性及抑制HepG2细胞的增殖作用，说明VB-1通过抑制ERK/FoxO3a信号轴抑制肝癌细胞增殖，要阐明所有参与VB-1抑制HepG2增殖的信号通路，尚需进一步相关研究。
总之，本研究结果证实阻断ERK/FoxO3a信号轴至少部分介导了VB-1抑制肝癌细胞增殖作用，有必要深入研究探索VB-1治疗人肝癌的潜能。
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Role of ERK/FoxO3a signal axis in inhibitory effect of
vitexin 1（VB-1） in HepG2 cell proliferation
ZHENG Xing-xing1， ZHANG Ren-shuo1， ZHOU Ying-jun2， WANG Jian-gang1*
（1.Department of Cardiology， the Third Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410013， China；
2. School of Pharmaceutical Science， Central South University， Changsha 410013， China）
[Abstract] Objective： To investigate whether the ERK/FoxO3a signal axis could induce the inhibitory effect of vitexin 1（VB-1） in HepG2 cell proliferation. Method： The MTT method was adopted to observe the effect of different concentrations of VB-1 on human hepatoma carcinoma cell line HepG2 and immortalized human embryo liver cell line L-02. The cell growth was assessed by the clone formation assay. The protein phosphorylation levels of ERK1/2 and FoxO3a were measured by the western blot. Result： VB-1 inhibited the viability of HepG2 cell line in a concentration-dependent manner， with a weak effect on L-02 cell line. VB-1 could effectively inhibit the anchorage-dependent growth of HepG2 cells， and reduce the expression levels of pERK1/2 and pFoxO3a in a concentration-dependent manner. MEK1/2 inhibitor PD98059 could enhance VB-1′s effect in inhibiting HepG2 cell proliferation and ERK1/2， FoxO3a phosphorylation. Conclusion： VB-1 inhibits the proliferative activity of hepatoma carcinoma cell line HepG2 by blocking the ERK/FoxO3a signal axis.
[Key words] hepatocellular carcinoma； vitexin； proliferation； ERK1/2； FoxO3a
doi：10.4268/cjcmm20140725