HIV—1型Nef基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

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@��ky"http://www.51feid.com/keys/pingjia.html" target="_blank" class="keylink">评价的方法工具，它还可以作为一种基因治疗的手段.2001年Tusehl研究组开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径.将RNAi用于病毒性疾病的治疗和预防研究取得了一些显著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人乳头瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].将RNAi应用于艾滋病治疗的文献也不计其数[17]，这些研究都为HIV1的基因治疗提供了很好的参考依据.但是RNAi还无法应用于临床治疗艾滋病，阻碍这一进程的是RNAi的传递模式.

2006年，向双林等提出利用修改过的非治病性细菌在体内及体外定向传递shRNA到靶细胞中以发挥干扰作用.他们将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术称之为TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].该研究的最终目的是将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术应用到干扰艾滋病病毒的基因研究中，试图探寻更有效的RNAi传递方法，为将RNAi应用到临床上治疗艾滋病提供理论依据.由于HIV病毒基因的RNAi干扰实验在体内无法进行，构建能够稳定表达HIV1型病毒蛋白的细胞模型显得至关重要.

本实验从pNL43质粒上扩增出Nef基因，随后与pEBMultineomyc质粒共同经BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接并转化构建成pEBmycnef真核表达质粒.通过菌液PCR验证、双酶切验证和DNA测序分析证明nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，培养48 h后，裂解细胞，收集蛋白，利用Western Blot技术检测到 Nef蛋白的瞬时表达.然后利用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，首次建立了稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞系，为研究tkRNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.

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