工作提示，沙利度胺能抑制IL-6，上调Cx43，本实验旨在利用体外细胞培养来观察沙利度胺对前列腺癌PC3细胞增殖及其IL-6、Cx43表达的影响，从细胞通讯的角度来探讨激素非依赖性前列腺癌分子机制。
1材料与方法
1.1材料
人雄激素非依赖型前列腺癌PC3细胞株由南方医科大学生物技术学院赠送。纯品沙利度胺购自常州制药厂。DMEM培养基、胎牛血清均购于美国Gibco公司；青霉素-链霉素溶液（100X）购自中国碧云天生物技术公司；IL-6、CX ELISA试剂盒、Annexin试剂盒均购置R&D Systems总公司；流式细胞仪：美国BD公司FACS Vantage产品，使用CellQuest软件系统进行分析。
1.2方法
1.2.1细胞培养及增殖试验检测 前列腺癌PC3细胞置于含10%胎牛血清DMEM培养基，37℃ 5%二氧化碳连续培养，取生长状态良好的PC3细胞，经0.25%胰酶消化，加入96孔板，以5×105个/孔接种到96孔培养板，每孔200 μl。实验分为空白对照组、沙利度胺实验组，实验组均设6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml共5个浓度，每个浓度设5个复孔。细胞呈对数生长期时加药，继续培养48 h后，每孔加入150 μl的MTT试剂（5 g/L），培养4 h，然后弃上清液，加入100 μl二甲基亚砜，震荡15 min。用酶标仪测定492 nm波长处（以630 nm为参考）的各孔吸光度D（λ）值，计算PC3细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组D492 nm/空白对照组D492 nm）×100%。
1.2.2细胞调亡实验 按上述实验，离心收集各处理组的细胞，按凋亡检测试剂说明步骤行Annexin V与碘化丙啶（propidium iodide，PI）双标染色，上流式细胞仪进行检测。
1.2.3 IL-6和Cx43检测 PC3细胞在培养24、48 h后，3000 r/min，4℃离心10 min，取上清液。按ELISA操作说明书检测Cx43和IL-6蛋白的表达。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件包对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验和方差分析，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P<0.05為差异有统计学意义。
2结果
2.1沙利度胺对PC3细胞增殖的影响
MTT法结果显示，细胞增殖均呈现不同程度的抑制，且随沙利度胺浓度增加、作用时间延长，沙利度胺对PC3细胞的增殖抑制作用逐渐增强，呈明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系。不同浓度沙利度胺作用PC3细胞24、48 h后，抑制率由1.3%增至48.6%（图1）。
2.2沙利度胺对PC3细胞凋亡的影响
不同浓度沙利度胺作用PC3细胞48 h后，25.00、50.00、100.00 μg/ml组凋亡率分别为（8.02±0.15）、（15.70±0.23）、（48.10±0.33），空白对照组细胞的凋亡率为（0.01±0.01），不同浓度的沙利度胺组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。
2.3不同浓度沙利度胺对PC3细胞中IL-6和Cx43表达水平的影响
随沙利度胺作用时间的延长，各实验组Cx43表达均逐渐升高，沙利度胺药物作用浓度最高100.00 μg/ml组表达最早且最明显，而沙利度胺药物浓度最低6.25 μg/ml组表达最不明显。IL-6随沙利度胺浓度、作用时间的延长，表达均逐渐降低，沙利度胺药物作用浓度最高的100.00 μg/ml组表达下降最明显，而沙利度胺药物浓度最低的6.25 μg/ml组表达最不明显。24 h后，100.00 μg/ml组Cx43、IL-6与其他组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；48 h后，25.00 μg/ml组、50.00 μg/ml组、100.00 μg/ml组优于空白对照组（P<0.05）。PC3细胞Cx43表达量与沙利度胺的浓度成正相关（r=0.915，P=0.010），而IL-6表达与沙利度胺浓度成负相关（r=-0.924，P=0.009）（图3）。
3讨论
激素非依赖性前列腺癌进展是多种因素、多步骤导致肿瘤微环境异常[12]，从而引起癌细胞以更恶性的生物行为复发，或获得雄激素非依赖性增殖能力，给临床上治疗带来困境。人Cx43主要通过形成细胞膜间的通道样结构，为肿瘤细胞和血管内皮细胞提供连接途径；Cx43通过细GJIC间接调控肿瘤细胞的生长和正常细胞的恶性表型转化，在前列腺癌进展过程中起一定的作用。研究显示，Cx43为前列腺基底细胞连接通讯点，其介导的GJIC对维持前列腺组织中的细胞稳态、调控细胞生长和分化起关键作用，GJIC功能异常可能会导致细胞的恶性转化；Cx43蛋白在前列腺癌组织中表达及其强度降低，且与前列腺癌恶性程度成负相关，说明癌细胞的GJIC水平普遍下降，导致了上皮细胞异常或不能控制其生长增殖和分化，进而促进了恶性表型的进展[9-11]。此外，IL-6作为炎性因子，参与调控包括前列腺癌在内的多种肿瘤的血管形成、肿瘤发生及转移过程，其机制多与JAK或Stat3信号通路有关。在LNCap细胞中，IL-6通过Stat3途径激活雄激素受体（androgen receptor，AR），上调VEGF表达，从而启动AR介导的基因表达。进一步研究证实LNCap细胞过表达IL-6，可增加前列腺特异性抗原mRNA的表达水平，降低LNCap细胞因雄激素阻断引起的凋亡[13-15]。同时，可诱导癌细胞的上皮细胞-间充质转化发生，与细胞间通讯功能有一定的关系[16-17]，目前机制不清楚。Cx43和IL-6均作用于肿瘤血管内皮细胞，可能使Cx43的羧基端S325与酪蛋白激酶1结合后磷酸化，影响VEGF和IL-6的表达。
沙利度胺作为抗肿瘤血管生成剂之一，能抑制相关血管生成因子如VEGF、bFGF的作用[18]，根据本课题组前期临床经验，在肺癌放化疗应用中具有良好的疗效[19]。本研究提示，沙利度胺作用于PC3细胞48 h后，凋亡率明显高于对照组（P<0.05），诱导细胞凋亡可能是其抑制PC3细胞增殖的机制之一；同时发现，随着沙利度胺浓度的增加，Cx43的表达增强，与肿瘤增殖明显成负相关；而IL-6的表达量减少，肿瘤增殖也减少。进一步阐明沙利度胺作用前列腺癌的机制，通过上调Cx43和抑制IL-6表达，恢复PC3细胞GJIC的功能来抑制前列腺癌生长。
在长期应用沙利度胺治疗肺癌的病例中，本课题组发现沙利度胺可以抑制IL-6的表达，但其最常见不良反应为心律失常，主要表现为房室传导阻滞和心动过缓[19]。Cx43分布于心房和心室[20]；沙利度胺在肿瘤治疗过程中，可能导致心肌Cx43的细胞缝隙连接的数量并使功能出现异常，引起心律失常，从这一个侧面印证了沙利度胺对Cx43的作用。这提示沙利度胺对IL-6和Cx43作用机制比较复杂，可能通过多条信号通路完成。本实验初步研究沙利度胺对PC3细胞中IL-6和Cx43的表达产生一定的影响，对于其作用机制有待于进一步研究。
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（收稿日期：2016-12-28 本文编辑：方菊花）
[作者简介]尹卫华（1976-），博士，副主任医师，主要从事肿瘤免疫研究
通讯作者：罗小瑾（1981-），硕士，副主任医师，主要从事泌尿外科疾病研究