工作液于4℃保存；有效期：-20℃为1年，4℃为半年），设计序列：引物名称：CALR-X9-Fwd，引物序列：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT；引物名称：CALR-X9-Rev，引物序列：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR体系包括DNA 50～100 ng，2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN公司产品）15 μL，正反向引物各0.5 μL，加去水离子补足体系至30 μL。反应条件：98°C预变性3 min，98°C变性10 s，63°C退火30 s，72°C延伸30 s，共29个循环，72°C延伸5 min。PCR扩增产物经回收、纯化后实验数据采用片段分析软件Genemapperid V4.1进行分析，分析示例见图1。
2 结果
2.1 72例MPN患者临床及实验室检查特点
根据2008年WHO分型诊断标准，PV 22例、ET 26例、PMF 23例、MPN-u 1例。所有患者均接受常规治疗至随访结束，患者均存活。在8例CALR突变的ET患者血小板计数高于JAK2突变阳性患者（表1）；8例CALR突变的PMF患者中7例为男性，发病年龄较小，且呈现出较低的白细胞计数、血红蛋白水平（表2）。
2.2 JAK2V617F、CALR及MPL515基因突变检测结果
22例PV患者中16例携带有JAK2V617F突变（突变率为68%），未检测出CALR基因突变；26例ET患者中12例携带有JAK2V617F突变（突变率为46%），8例检测出CALR基因突变（突变率为31%），JAK2V617F突变阴性患者中CALR基因突变率为57%（8/14）；23例PMF患者中11例携带有JAK2V617F突变（突变率为49%），8例检测出CALR基因突变（突变率为35%），JAK2V617突变阴性患者中CALR基因突变为为67%（8/12）。在72例患者中均未检测到MPL515突变。
3 讨论
CALR为Ca2+结合蛋白复合体，主要定位于内质网（edoplasmic reticulum，ER）腔内。CALR基因定位于染色体19p13.2～p13.3，包含9个外显子，大小为4.2 kb，其编码的CALR由高度保守近似球形结构的N端（1～180氨基酸残基）、参与ER内Ca2+储存的酸性c端（291～400氨基酸残基）及中间富含脯氨酸而形成的具伸出式结构的P端（181～290氨基酸残基）。3个结构域均具有各自特殊的功能，N端及P端主要发挥分子伴侣的作用，C端的作用主要为调节ER中的Ca2+浓度，保持细胞内Ca2+稳态，CALR基因缺失将减少ER内Ca2+的储存量。CALR C端的终点为ER滞留信号（KDEI）肽，KDEL可使CALR从高尔基体回到ER，阻止其分泌至ER外，具有靶向定位作用。多项研究发现CALR突变呈阳性MPN患者骨髓细胞中突变型CALR大部分定位于ER内[6]。同时，CALR介导的Ca2+稳态的调节可影响多种细胞功能，包括巨核细胞分化成熟及血小板的形成、整合素介导的信号转导、免疫应答、细胞凋亡、增殖及吞噬作用、介导伤口愈合及纤维化。早期研究证实BCR/ABL1阴性MPN患者存在JAK2V617突变。Kampfl等[6]和Nangalia等[7]采用外显子测序的方法在JAK2/MPL阴性的大部分标本中检测到CALR第9个外显子突变。并对大样本健康人群进行CALR目标基因检测，结果发现在健康个体对照组、淋巴系肿瘤、急性白血病及实体肿瘤中均未见CALR基因突变。结果提示CALR基因突变为JAK2及MPL基因突变阴性的ET及PMF的特异性分子标志物。因CALR基因突变均位于第9个外显子，本研究采用直接检测第9个外显子的方法在JAK2基因突变阴性的ET患者中检测到CALR突变率为57%；23例PMF患者中8例检测出CALR基因突变（突变率35%）；研究表明，CALR基因突变不会发生在PV患者中，本组22例患者中均未检测到CALR基因突变也证实了这一观点。2014年，Tefferi等[8]检测了576例ET患者中，CALR的突变率为15%；Rumi等[9]检测了745例患者，CALR的突变率为24%；Chi等[10]检测了289例患者，CALR的突变率为9%；Kim等[11]检测CALR突变率为12.6%。本实验中ET患者CALR的突变率为31%，在JAK2/MPL阴性的ET患者中突变率57%，而国内学者报道436例亚洲人CALR基因突变情况，CALR基因的突变率为22.7%，在JAK2/MPL阴性的ET患者中，其突变率为52.7%，本实验与国内报道相符。Rumi等[12]对CALR 突变呈阳性ET患者研究发现，极少数患者的CALR突变的等位基因负荷>75%，该结果推测ET的发生可能为杂合子克隆逐步积累，最终在骨髓中占据数量优势，特异性刺激巨核细胞导致。本研究显示CALR 突变患者均为杂合子。本研究中PMF患者CALR基因突变（突变率35%），与Langabeer等[13]报道的25%～35%的突变率相似。研究发现CALR突变与其临床表现和预后有重要的相关性。在ET和PMF患者中，CALR基因突变PMF患者较JAK2突变者血小板计数更高、年龄更小、血红蛋白更低，白细胞计数更低，PMF患者具有更好的生存率[14]，本研究中患者也具有以上临床特点。有文献报道发生CALR和JAK2突变者发生心血管事件的概率是13.4%和30.1%，10年血栓症累计发生率分别为5.1%和14.5%。在PMF患者中，Tefferi等[8]在254例标本中筛查了一些与MPN相关的基因突变，发现他们与CALR突变没有显著的分子或遗传学关联。Tefferi等[15]也报道在PMF患者中，发生1型CALR突变者比2型突变者有更好的预后。由本组实验可以看出，CALR是MPN中较易发生突变的基因，可将CALR突变检测纳入MPN诊断的常规指标。在临床上可以遵循以下思路考虑对MPN的诊断[16-20]：①由于CALR突变不发生在PV的患者，所以它不能用来筛查PV或PV后骨髓纤维化的疑似患者；②CALR、JAK2和MPL突变是互相排斥的，对已知发生了JAK2 或MPL突变的患者无需筛查CALR突变；③由于MPL突变率在三者中最低，对ET或PMF的疑似病例，应先行JAK2V617突变筛查，若阴性再行CALR突变筛查，CALR阴性则行MPL突变筛查。尽管CALR基因突变等为疾病的诊断提供了较为特异的分子指标，但仍有10%的ET和PMF患者需要结合骨髓病理检查结果加以诊断。
综上所述，CALR基因突变是JAK2V617F突变阴性的MPN特异性分子标志物。将CALR基因突变检测纳入MPN诊断标准可以提高诊断的准确性减少漏诊率。CALR基因突变的检测有助于JAK2V617F突变阴性的MPN的鉴别诊断，对CALR基因突变功能的进一步研究可望找到JAK2V617突变阴性MPN的分子治疗靶标。
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（收稿日期：2015-06-12 本文编辑：苏 畅）