【摘要】 目的：探讨调节性T细胞的变化与白细胞介素10、6（ IL- 6，10）、干扰素-γ（ IFN-γ）在梅毒血清固定机制中的作用。方法：流式细胞仪测定112例梅毒血清固定患者，155例梅毒血清转阴患者和58例正常人的外周血调节性T细胞及其特异性因子Foxp3的表达；酶联免疫吸附试验（ ELISA）方法检测其血清IL-6，IL- 10和IFN-γ的水平。结果：梅毒血清固定患者外周血CD4+的表达为（1.95±0.66%），而其中调节性T细胞比例为（24.5±7.63%），较两组对照组均显著升高（P<0. 01） ， CD4+T细胞内转录因子Foxp3表达量（2272.7±876.8）明显高于两组对照组（P<0.01）； 与对照组相比，梅毒血清固定患者IL-6、IFN-γ水平较低而IL-10水平较高（P<0.01）；血清转阴患者与健康献血者三者水平差异无显著性（P>0. 05）。结论：调节性T细胞比例的升高以及Th1 /Th2比例失衡可能导致了梅毒血清固定。
【关键词】 梅毒； 血清固定； 调节性T细胞； 白细胞介素6； 干扰素-γ
梅毒是一种由梅毒螺旋体（Treponema palladium， TP）引起的一种慢性、全身性性传播性疾病，几乎可以侵犯全身各器官、系统，造成多个器官损害；有很多研究认为，机体对T P的免疫应答主要由细胞免疫引起[1-3]。虽经正规治疗， 仍会有少数患者血清RPR反应持续阳性，这种现象称为梅毒血清固定。血清固定的发生除与药物治疗量不足、不规则或再感染有关外，机体细胞免疫功能受到一定的抑制也是重要因素[1-3]。众所周知， Th1型的细胞因子主要介导细胞免疫反应；而Th2型的细胞因子则介导体液免疫反应，并且能抑制Th1的细胞免疫[1，3，4]。本研究选取检测了代表Th1型细胞因子（ IFN-γ， IL-6）及代表Th2型细胞因子（ IL-10）在梅毒血清固定患者中浓度水平，以探讨梅毒血清固定的形成与Th1 /Th2比例失衡的关系。我们通过流式细胞仪测定梅毒患者外周血调节性T细胞与其特异性转录因子Foxp3的定量表达情况；ELISA方法检测血清中IL-12和IFN-γ的水平，分析调节性T细胞水平与IL-12和IFN-γ水平的相关性，探讨调节性T细胞及IL-10、IL-12以及IFN-γ在梅毒血清固定机制中的作用。
1材料与方法
1.1病例选择
病例112例为我院已经规范驱梅的治疗（苄星青霉素240万U肌肉注射，每周1次，连续3周以上）后诊断为血清固定者（早期梅毒治疗6个月，晚期梅毒治疗12个月后，其TRUST检测滴度固定在某个水平左右且不阴转持续3个月者定义为血清固定）。其中男62例，女50例；平均年龄（30.6±6.3）岁；所有患者进行血HIV抗体、RPR、TPPA及梅毒IgM抗体检测；排除再感染、神经梅毒和HIV感染；治疗后以TRUST试验血清阴性者155例为对照组A ； 以58例健康献血者为对照组B。
1.2方法与步骤
1.2.1主要试剂和仪器IL-12、IL-10和IFN-γ 的ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司） ，TPHA试剂盒（富士株式会社，日本），RPR试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司） ；荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC，CD25-PerCP-Cy5.5抗体，Foxp3荧光抗体（eBioscience公司，美国）。Quanti BRITE PE流式定量试剂盒（BD公司，美国）；RPMI 1640（Sigma）。Mode-l 680型酶标仪（BIO RAD，美国）。流式细胞仪（ BD公司，美国）。
1.2.2标本制备分别抽取3例梅毒患者、血清固定患者和正常对照组的空腹外周血4ml加入15%的抗凝剂乙二胺四乙酸；其中的2ml血用于流式细胞学检查，另外的2ml血低温4～5℃离心3000r/min，10min后取上层血清，弃沉淀，置于-20℃冰箱中保存用于ELISA检测。
1.2.3直接免疫荧光标记取抗凝全血100μl，加入荧光抗体D4-FITC，CD25-Per CP-Cy5.5各100μl。每份血标本设同型对照，对照管中加入抗凝血100μl，加入荧光抗体IgG1- FITC /PE 20μl，。 避光下室温孵育30min；加入红细胞溶解液0.5μL，孵育作用15min，1200r /min 低速离心5min，弃上清留沉淀。
1.2.4流式细胞检测用适量PBS液重悬细胞后用流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞的目标因子，结果采用分析软件Cell Quest进行主要参数的数据分析。
1.2.5细胞内Foxp3的分子定量流式细胞检测用QuantiBRITE流式定量试剂盒，参照使用说明书进行实验。测得各组微球几何平均荧光强度（GMFI）及其所对应的荧光素分子数分别取对数后求回归方程。所求得回归方程为y=1.0108x+2.4306（y为lg分子数，x为lg荧光强度）。取细胞悬液先用CD4与CD25进行标记，再进行破膜固定后加入PE标记的Foxp3单克隆抗体进行细胞内分子标记；然后上机监测，测得GMFI；将GMFI值代入回归公式求得相应分子表达量。
1.2.6ELISA检测IL-6、IL-10、IFN-γ以标本稀释液将冻干的标准品进行复溶，静置15min后混匀（终浓度为2000pg /mL） ； 进行倍比稀释成7个梯度差浓度。取出所需板条，将标本和不同梯度浓度的标准品加入孔中（100μL每孔），预留空白对照孔；室温（20～25℃）孵育120min，PBS洗板4次；除空白孔外，加入100μL/孔的工作液，室温孵育60min； PBS洗板4次；加入底物（50μL每孔），避光室温孵育25min。加入终止液（50μL每孔） 终止反应。混匀后即置于酶标仪上测量OD450的吸光度。应用Curve Expert 1.3软件绘制出浓度标准曲线并计算出相应待测标本的血清浓度。
1.3统计学分析
采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析计算；多组间的均数比较采用Mann-Whitney U检验，各组间差别则用Bonferroni法分析。外周血调节性T细胞表达水平与血清中IL-6， IL-10，IFN-γ之间的相关性检验采用Pearson相关分析；与梅毒血清滴度的相关性检测采用Spearman秩和相关分析。检验水准为a<0.05。
2结果
对照组与血清固定患者外周血CD4 +CD25+调节性T细胞在CD4 +细胞中所占百分比情况及Foxp3的表达分子数情况见表1。结果表明，血清固定患者的外周血调节性T细胞表达比例均高于对照组A与B组（t= 7. 15，P< 0. 01）。实验组外周血Foxp3的含量明显高于对照组A与B组（P< 0. 01）。
3讨论
很多研究认为梅毒血清固定与机体的细胞免疫功能失衡或免疫系统受到抑制有关[3-6]，Th1型细胞的减少使体内Th1 /Th2平衡失衡，而Th2型细胞可通过分泌细胞因子IL-10等并抑制由Th1细胞分泌的细胞因子介导的免疫应答，造成免疫杀伤与清除能力的下降，使梅毒螺旋体逃过细胞免疫应答的作用，引起血清抗体持续固定[4-6]。有研究认为CD4+CD25+调节性T细胞在感染性疾病中可起到抑制机体免疫反应的作用，并限制免疫应答。CD4+CD25+调节性T细胞水平的增多可抑制自身免疫性疾病的发生，并能导致感染扩散并造成感染后的血清抗体持续阳性表达，无法清除[6-8]。因而，只有当CD4+CD25+调节性T细胞与其效应细胞因子处于相对平衡状态时，机体才能维持正常的免疫功能和免疫应答。Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞的特异性转录因子， Foxp3可通过抑制免疫反应并促使调节性T细胞的分化，还可抑制CD4+CD25 T细胞对IL-2的反应性，干扰CD4+Th细胞对CD8+T细胞的辅助作用，进一步诱导梅毒血清固定的发生[8-10]。
我们研究结果显示CD4+CD25+调节性T细胞在梅毒血清固定患者中的比例，以及Foxp3分子的表达显著高于梅毒转阴对照及正常人。我们认为，梅毒患者外周血中的调节性T细胞所占比例异常升高，使机体的细胞免疫功能受到抑制，失去抵抗或吞噬梅毒螺旋体感染以及消除已感染的梅毒抗体的能力；经治疗后体内仍可有梅毒螺旋体的存在，并持续不断刺激机体产生抗体，血清抗体持续阳性表达，导致血清固定的发生。有研究认为，降低CD4+CD25+T细胞水平可增强对多种病原体的抗感染免疫，能抑制机体对侵入病原体的有效保护性免疫应答[11-13]。因此，我们推测CD4+CD25+调节性T细胞在梅毒患者治疗后发生血清固定，抗体无法完全清除中可能起着重要的作用。本研究初步检测了不同血清学表现的梅毒患者的外周血CD4+CD25+调节性T细胞水平与比例；而在不同时期免疫抑制功能的强弱变化还有待于进一步研究。
Podwinska等[14]研究发现在早期梅毒的抗体阳性血清中， ELASA法检测到IL-2、TNF和IFN-γ等Th1型细胞因子可高表达，而Th2型的细胞因子IL-10的表达则显著下降。Van Voorhis等[15]发现在早期梅毒的病灶组织中荧光PCR法检测到IL-2、IL-10、IL-12及IFN-γ的表达，并且证实了由IFN-γ可激活吞噬细胞，后者在梅毒血清抗体的清除中起到主要作用。Th2细胞可通过分泌因子IL-10和转化生长因子TGF-β来抑制Th1细胞活性的功能，抑制由Th1介导的细胞免疫应答，其中IL-10还可以抑制INF-γ的产生从而抑制巨噬细胞的活化，还可进一步导致IL-2、IL-6分泌水平下降，使得机体保护性清除梅毒螺旋体抗体的细胞免疫功能下降。本研究结果显示，血清固定组IFN-γ和IL-6浓度最低，而介导免疫抑制的因子IL-10浓度较高；两个对照组中的IFN-γ， IL-10和IL-6无显著性的浓度差异，表明梅毒患者治愈后血清转阴性的Th1型免疫反应抑制的现象随着Th1 /Th2平衡的纠正而得以恢复，其CD4 + CD25 +调节性T细胞较血清固定组也有明显升高。
本研究显示血清固定患者存在Th1/Th2细胞比例及功能的失衡，提示调节性T细胞在梅毒血清固定的形成中可能起到重要作用，而血清固定的发生和迁延是否与梅毒螺旋体本身的基因型差异以及机体本身的遗传免疫功能特异性有关，则需要进一步研究和探讨。
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[收稿日期：2013-02-22]