摘 要:利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simplicissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的TDNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.
关键词:根癌农杆菌;简青霉;转化
中图分类号:Q933 文献标识码:A
Agrobacterium Tumefaciensmediated Transformation
of the Penicillium Simplicissimum H5
ZHU Yonghua,WU Kang,ZHENG Mang,JIN Ran,LIAO Hongdong,LIU Xuanming
(State Key Laboratory of Chemical Biosensing and Chemometrics,School of Biology, Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082, China)
Abstract:Agrobacterium tumefaciensmediated transformation (ATMT)was applied in Penicillium simplicissimum H5 by Agrobacterium tumefaciens LBA4404. The results of hygromycinresistance selection, PCR and Southern blot analysis showed that TDNA was randomly inserted into the transformants with single copy and the transformants indicated genetic stability. The transformation efficiency was about 50 transformants per 105 spores by optimizing the coculture time, the concentration of Agrobacterium tumefacien and acetoyringone (AS).The application of ATMT technique in Penicillium simplicissimum H5 will provide a powerful tool for the genetic engineering of this fungus.
Key words:agrobacterium tumefaciens;penicillium simplicissimum;transformation
自然界中木质素储量非常丰富,能提供稳定、持续的有机物质来源.但木质素结构的复杂和无规则性,使其成为自然界最难降解的成分之一,限制了该资源的充分利用.迄今为止,大多数木质素仍以堆积、荒烧、废水等形式直接倾入环境,造成极大污染和浪费.而且植物组织中木质素与半纤维素一起构成了包裹在纤维素周围的基质,它的难降解和转化也限制了纤维素的转化.因此,选育高产木质素降解酶的微生物是国内外的研究热点之一.
真菌是目前最有效的木质素降解微生物,但真菌类降解木质素仍存在木质素分解酶活力低、处理时间长等技术问题[1],对于真菌的基因工程改造有望解决该问题.目前对于真菌的转化大多是PEG/CaCl2、电转化、脂质体转化等方法,这些方法存在转化率低、遗传不稳定、操作复杂等缺点[2].缺乏有效的转化体系制约着真菌基因工程的研究.根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT)是近年来逐渐兴起的应用于丝状真菌遗传转化的一种高效率转化方法,其基本原理是利用农杆菌介导将TDNA插入到真菌的宿主基因组中.这种转化方法与常规的转化方法相比,具有转化率高、低拷贝、遗传稳定、操作简单等优点[3].由于不同丝状真菌对于农杆菌的种类、Ti质粒载体启动子的特异性要求不同,目前只有数十种真菌成功构建根癌农杆菌介导的转化体系[3-4].受根癌农杆菌的侵染能力的影响,目前用于转化的农杆菌菌株仅有AGL1,LBA1126和LBA1100等几种,虽然LBA4404菌株是在植物遗传转化中最常用的农杆菌之一,但用LBA4404菌株转化丝状真菌的成功例子并不多[5].
简青霉(Penicillium simplicissimum)是目前发现的木质素降解真菌中的一种,它的优势在于具有木质素降解能力的同时,兼具产生纤维素酶和半纤维素酶的特点[6].目前,针对简青霉的木质素降解能力的开发研究较少,尚未成功建立简青霉的遗传转化系统.为此,本文采用根癌农杆菌LBA4404介导转化了一株能降解木质素的简青霉H5菌株,得到了稳定遗传的转化子,并且对部分转化系统进行了优化,为获得高效木质纤维素降解真菌提供基础.
1 实验部分
11 材料与试剂
简青霉(Penicillium simplicissimum)H5菌株,由湖南大学环境科学与工程学院筛选并提供[7].农杆菌菌株LBA4404由本实验室保存,质粒pPK2购自美国FGSC (Fungal Genetic Store Center)公司;潮霉素、头孢霉素和卡那霉素购自美国罗氏公司;N+尼龙膜购于美国Amersco公司;DNA 分子量标记物、Taq DNA 聚合酶和限制性内切酶HindⅢ购于日本TaKaRa 公司;Southern blot试剂盒购自美国GE公司;潮霉素抗性基因hph所用引物序列为:hph1(5"CGC CCAAGCTGCATCATCGAA3")和hph2(5"CGAC AGCGTCTCCGAC CTGA3"),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.
12 实验方法
1.2.1 简青霉H5对潮霉素的敏感性
100 μL H5孢子悬液(106孢子/mL)与100 μL H2O混合均匀后涂布到覆盖有玻璃纸的含潮霉素的MEA(g/L:麦芽浸粉 20,葡萄糖 20,蛋白胨 1,琼脂 15)平板上,平板的潮霉素梯度浓度分别为:0,100,150,200,250和300 μg/mL,28 ℃培养4d,观察结果,实验重复3次.
湖南大学学报(自然科学版)2010年
第10期朱咏华等:根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究
1.2.2 根癌农杆菌LBA4404的转化
采用冻融法将质粒pPK2直接转化到农杆菌LBA4404中[8],转入含50 μg/mL 卡那霉素的YEB(g/L:蛋白胨 5,蔗糖 5,牛肉膏 5,酵母提取物 1,MgSO4 0.24,pH 7.2)平板上培养,挑取成功转化的单菌落保存.
1.2.3 简青霉H5遗传转化
将简青霉H5接种于MEA培养基上,28℃避光培养4 d,用无菌生理盐水洗下孢子,用血球计数板计数,孢子悬液稀释至106个/mL.
将农杆菌菌种LBA4404(pPK2)在YEB培养基(含50 μg/mL 卡那霉素)上活化、划线分离单菌落(28 ℃,48 h,避光),挑取单菌落接种于含有200 μmol/L乙酰丁香酮(AS)的YEB液体培养基中,28 ℃,摇床培养约48 h.检测菌液OD600的值,稀释至OD600=0.15,继续培养6~12 h.取100 μL H5孢子悬液和100 μL活化好的LBA4404(pPK2)混匀后,均匀涂布到表面铺有玻璃纸的IM(g/L:K2HPO4,1.45;KH2PO4,2.5;NaCl,0.15;MgSO4,0.5;CaCl2,0.066;FeSO4,0.000 8;(NH4)2SO4,0.5;葡萄糖,1.8;40 mM,2[NMorpholino]ethanesulfonicacid,0.5%甘油(W/V),pH5.3)固体培养基上,28 ℃避光培养2 d.将玻璃纸转移到含潮霉素的MEA平板上,28 ℃继续培养2~4 d,挑取长出的单菌落在无潮霉素的MEA平板上传3代,再接种到有潮霉素的MEA上传3代,若抗性稳定,则初步认定为简青霉转化子,保存菌种.
1.2.4 转化子的PCR分析
采用文献[9]的方法提取菌株的总DNA,采用20 μL反应体系:DNA约100 ng,引物10 pmol,1×PCR缓冲液,dNTPs 200 μmol,0. 25U Taq酶.反应条件为94 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,循环28次,72 ℃延伸10 min,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.5 转化子的Southern blot分析
菌株的总基因组DNA和质粒pPK2经限制性内切酶HindⅢ(37 ℃)酶切12 h,产物经琼脂糖凝胶电泳后转移到N+尼龙膜上,将Dig标记的hph基因片段作为探针,进行Southern blot分析,杂交和信号检测按照Southern blot试剂盒说明书进行.
2 结果与讨论
21 简青霉H5对潮霉素的敏感性
潮霉素是一种十分方便的显性选择标记,培养基中合适的潮霉素浓度能有效地抑制野生型简青霉的生长[10]. 根癌农杆菌介导的转化能将pPK2质粒中的hph基因导入简青霉菌株中,使简青霉转化子菌株生长不受潮霉素影响而被筛选出来.为了确定筛选培养基中潮霉素的浓度,对简青霉H5孢子在不同浓度的潮霉素MEA平板接种3 d后的生长状况进行比较,结果如表1所示:未加潮霉素的平板上的H5菌落变为绿色,表明H5菌株在MEA平板生长良好.随着平板潮霉素浓度的增加,H5菌株生长状况逐渐变弱,当潮霉素浓度为300 μg/mL时,MEA平板则完全没有出现H5菌落,表明300 μg/mL潮霉素浓度即可筛选简青霉H5菌株转化子.
随机选取5株经潮霉素筛选的转化子,以野生型H5菌株为阴性对照,质粒pPK2为阳性对照,提取菌株的总DNA,用针对潮霉素抗性基因hph所设计的引物hph1和hph2进行PCR扩增.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示:所挑取的转化子的扩增产物在750 bp处均呈现出与阳性对照相同的特异性片段,而阴性对照没有特异条带出现,初步说明潮霉素抗性片段插入至简青霉转化子的基因组中.
为了确定TDNA 在转化子中整合的情况并且进一步验证PCR结果,随机挑出4个经PCR初步鉴定的转化子,以野生型H5为阴性对照,以质粒pPK2扩增得到的hph片段为探针与基因组DNA进行Southern blot分析.从图2中可以看出,随机选取的4个转化子以及pPK2质粒均呈现出一条明显的杂交条带,说明pPK2质粒中的hph片段成功的随着TDNA插入到转化子的基因组中,且都是以单拷贝的方式整合.由于是用的单酶切,故杂交片段大小不一.
24 转化条件的优化
为了提高农杆菌介导的简青霉转化体系的效率,实验对根癌农杆菌的转化OD值、AS浓度和共培养时间等方面做了研究.
2.4.1 根癌农杆菌OD值对简青霉H5转化效率的影响
根癌农杆菌介导的高效转化需要合适的农杆菌浓度,即需要与真菌的孢子数目保持一定的比例关系.农杆菌浓度太小则相对于单个真菌孢子而言达不到转化所需要的浓度,浓度过大则可能会抑制孢子的生长,导致转化失败或者转化效率太低.分别采用OD600 值为0.6,0.7,0.8,0.9和1 等5个浓度梯度的农杆菌对简青霉H5(孢子浓度为106个/mL)进行转化.从图3中可以看出,转化效率在农杆菌OD600=0.6,0.7时较低,而当农杆菌OD600=0.8时出现一个明显的跃迁,转化效率达到最高,可能与农杆菌的生长周期以及简青霉H5孢子本身的特点有关.农杆菌OD600=0.9,1.0时转化效率则有降低的趋势,并且出现较多假阳性.可见,选取OD600值为0.8的农杆菌进行转化能够获得很好的效果.
根癌农杆菌OD值(OD600)
2.4.2 乙酰丁香酮(AS)的浓度对简青霉H5转化效率的影响
共培养基中AS能起到诱导活化农杆菌vir基因的作用,浓度太低会导致农杆菌病毒蛋白表达量不够,难以完成转化, AS浓度过大可能会导致T-DNA插入的拷贝数目增加[11],不利于相关基因功能的研究.调整转化过程中的AS浓度,使其分别为10,150,200,250和300 μmol/L,测定AS浓度对于简青霉转化效率的影响.从图4中可以看出,随着共培养基中AS浓度增高,转化子数目也相应增加,但当AS浓度达到250 μmol/L时转化子数目达到最高,再增加AS浓度(300 μmol/L)转化效率反而有降低,所以250 μmol/L可作为最佳添加浓度.
2.4.3 共培养时间对简青霉H5转化效率的影响
共培养时间的长短关系到农杆菌vir基因的表达及其蛋白的活化以及TDNA的剪切和复合物向孢子内的转移,过短的共培养时间将导致转化无法顺利完成.但是共培养时间太长,非转化子对转化子生长的竞争作用将导致转化效率降低,加大假阳性出现的概率[12].调整共培养时间分别为24,36,48,60和72 h,研究其对简青霉H5转化效率的影响,结果如图5所示:共培养较短(24 h,36 h)时,转化子数量稀少,随着共培养时间的延长(48 h),转化子数目增多,而继续延长共培养时间(60 h,72 h)时,转化子数目则显著减少.当共培养的时间较短时,转化子数目较少,可能是由于农杆菌的病毒蛋白活力不足或者TDNA的剪切和插入没有完成,当共培养时间适当增加至48 h时,转化子数目明显增多,再延长时间转化子数目反而迅速减少,可能是由于非转化子的竞争导致的.
根癌农杆菌介导的转化,其受体材料是多种类型的,既可以用原生质体,也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体.用于转化的农杆菌由于其遗传背景和侵染能力的不同,其对于真菌的转化效率也不同甚至无法完成转化.本文成功的构建了基于根癌农杆菌LBA4404和质粒pPK2的H5菌株遗传转化系统,优化后转化效率约为50个转化子/105个孢子,远高于青霉属传统方法转化的效率.该转化系统的成功构建为研究简青霉的功能基因组提供强有力的工具,有助于进一步阐明简青霉H5菌株降解木质素类的机理,对通过遗传改造的方法得到高效降解木质素类物质的工程菌株有重要意义.
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