[摘要] 目的:了解HBV感染的不同血清学组合的HBV-DNA阳性情况。方法:对324例血清同时进行ELISA方法测定HBV-M及荧光定量PCR法检测HBV-DNA。结果:HBsAg(+)组HBV-DNA阳性率为78.4%(254/324),HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率为4.8%(5/103),两组间差异有统计学意义(P<0.05)。HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为100.0%(120/120),平均含量为1.61×107拷贝/ml;HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为47.0%(76/162),平均含量为3.42×104拷贝/ml;HBsAg(+)HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为69.0%(29/42),平均含量为6.32×103拷贝/ml;HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)血清HBV-DNA阳性率为5.2%(5/96),平均含量为4.12×101拷贝/ml。结论:定量PCR可真实反映HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义。
[关键词] 乙型肝炎病毒;DNA;ELISA
[中图分类号] R512.6+2[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210(2010)06(b)-064-02
The relationship between quantitative detection of HBV-DNA and its serological markers
PENG Jiliang1, WEN Xiuming1, XU Ruihuan2, SHEN Cishi1, HE Chunhui1
(1.Shenzhen Longgang Blood Station, Shenzhen 518172, China; 2. Longgang Central Hospital of Shenzhen City, Shenzhen 518116, China)
[Abstract] Objective: To study the HBV-DNA positive rates under its different serological groups. Methods: 324 HBV serum were detected by ELISA and quatitative PCR technique. Results: The HBV-DNA positive rate was 78.4% (254/324) in HBsAg positive group,and 4.8% (5/103) for HBsAg negative group, the differences between the two groups were statistically significant (P<0.05). 100.0% positive rate of HBV-DNA was to HBsAg(+) HBeAg(+) HBcAb (+) serum about average 1.61×107 copies/ml, 47.0% (76/162) to HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+) about 3.42×104 copies/ml, 69.0% (29/42) to HBsAg(+)HBcAb(+) about average 6.32×103 copies/ml, 5.2%(5/96) to HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+) about average 4.12×101 copies/ml. Conclusion: Quantitative PCR can really reflect HBV infection and duplication and disease progress, it provides much more information for HBV diagnosis and therapy.
[Key words] Hepatitis B virus; Deoxyribonucleic acid; Ensyme linked immunosorbent assay
近年来随着分子生物学技术的发展及其在临床应用方面的推广,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测 HBV 病毒载量已成为目前临床诊断 HBV 感染的常用指标,进一步提高了检测的质量。同时采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎病毒HBV标志(HBV-M)简便易行,一直为许多临床科室使用。临床上有必要把此两种方法的检测结果联合起来进行分析,指导临床应用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
2009年6～9月来我院住院及门诊的423例患者,年龄13～66岁。所有标本用无菌管留取血样3 ml,于3 h内分离血清,并冻存于20℃冰箱。
1.2 主要试剂
HBV-DNA定量诊断试剂由深圳市匹基生物技术公司提供。HBV-M测定用酶联免疫吸附试验(ELISA),试剂由上海科华生物工程公司提供。
1.3 检测方法
1.3.1 ELISA法按试剂说明书进行。
1.3.2 荧光定量PCR法检测HBV-DNA①样本处理,取待测血清或血浆样本以及试剂及试剂盒中的对照各100 μl,分别加到0.5 ml离心管中,100 μl DNA提取液1,振荡混匀,13 000 r/min离心10 s,25 μl DNA提取液2,振荡10 s,200 r/min离心10 s,100℃干浴或沸水浴10 s,13 000 r/min离心10 s,保留上清备用。②反应体系为40 μl:37.6 μl PCR反应液、0.4 μl Taq酶、0.06 μl VNG及2 μl提取物。③循环条件为:37℃ 5 min、94℃ 1 min、95℃ 5 s,60℃ 30 s 42个循环。荧光信号收集在60℃。
1.3.3 污染的控制标本的处理、试剂的配制、上样及PCR扩增检测严格分室进行,每次检测均设强阳性、临界阳性、阴性、质控试剂参照品。
1.4 检测仪器
美国ABI公司生产的ABI7500荧光定量PCR仪,芬兰Labsystems生产的Multiskan MK 3酶标仪。
1.5 统计学方法
对所得数据进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较
324例血清标本HBV-DNA表达情况见表1。
表1 HBsAg(+)组与HBsAg(-)组HBV-DNA阳性率的比较(%)
Tab.1 The comparasion of HBV-DNA between HBsAg(+)group and HBsAg(-)group (%)
由表1可见,HBsAg(+)组HBV-DNA阳性率为78.4%,有21.6%的阴性率。HBsAg(-)组HBV-DNA阴性率为95.1%,有4.8%的阳性率,组间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果
324例血清标本HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果见表2。
表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA检测结果
Tab.2 The results of HBV-DNA under HBV different serological makers
由表2可见血清HBsAg HBeAg HBcAb阳性组合HBV-DNA阳性率为100.0%,拷贝数达到1.61×107拷贝/ml。HBsAg、HBcAb、HBsAg HBeAb HBcAb、HBsAb、HBeAb、HBcAb阳性率依次降低。
3 讨论
酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎病毒已成为临床常规。乙肝五项的检测为临床提供一定的信息[1-3],但对HBsAg阴性者,本实验发现有5%的 HBV-DNA阳性,且拷贝数在104拷贝/ml 左右,与某些文献报道相似[4-5]。其原因可能由于:①HBV发生变异,其前S区变异率比S区高2倍;前C/C区变异研究较多。②HbsAg的表达可能较低或其抗原性改变较大,用现有的试剂检测不出。③形成免疫复合物,有人发现血中免疫复合物的存在可能影响HbsAg的检出[6]。
乙型肝炎病毒DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况[7-9],本试验结果为HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA全部阳性,平均含量为1.61×107拷贝/ml; HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为47.0%,平均含量为3.42×104拷贝/ml;HBsAg(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为69.0%,平均含量为6.32×104拷贝/ml,而HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA阳性率为5.2%,平均拷贝数为4.12×104拷贝/ml,由此可以看出血清中乙型肝炎病毒DNA拷贝数与其血清学指标组合是相匹配的,对乙型肝炎的临床诊断,特别是对其疗效有较大的指导意义[10-11]。本实验发现HBsAg(+)HBcAb(+)的阳性率为69.0%,比HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的阳性率(47.0%)高,且差异有统计学意义(P<0.05),有两种可能解释,一是HBV复制减少或停止,一是HbsAg前C基因发生变异。根据Ferruccio Bonino来华报道,急性乙型肝炎时HBV标志物的变化图显示HBsAg(+) HBeAb(+)HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率明显低于HBsAg(+)HBcAb(+)时的HBV-DNA阳性率。
本实验所用的BIO-RADicycler荧光定量PCR技术灵敏度高,操作简单,克服假阳性结果,无需PCR后处理,防污染效果好,可直接反映病毒在体内的存在情况,已为临床普遍应用。血清学ELISA方法是检测病毒侵染机体产生的免疫反应,间接反应病毒的感染状况。对于 HBeAg 与 HBV 病毒载量之间的关系,一般认为两者的水平存在一定程度的一致性。本试验显示两者既有相关,又不尽一致,临床上需要将两者结合起来对患者进行诊断和治疗。
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(收稿日期:2010-05-10)