摘要：建立了一种利用外切酶保护－荧光定量ＰＣＲ检测环境激素邻苯二甲酸酯的方法。将从鱼肝脏中提取含雌激素受体的细胞溶质，与不同浓度的邻苯二甲酸酯结合，采用常规ＰＣＲ方法扩增制备双链结合ＤＮＡ，将其与配体－受体复合物反应的结合物，用核酸外切酶ＥｘｏⅢ和Ｓ１核酸酶处理，消解游离ＤＮＡ，并以消解后产物作为模板，进行荧光定量ＰＣＲ扩增反应，建立Ｃｔ值与邻苯二甲酸酯质量浓度Ｃ（ｇ／Ｌ）的对数标准曲线：Ｃｔ＝－０．２７３ ｌｇ（Ｃ）＋６．３２０。将该方法应用于水样中邻苯二甲酸酯的检测，最低检测限达到１０～１００ μｇ／ｍＬ。该法准确度高、抗干扰性强、适用于检测大批量环境样品中邻苯二甲酸酯。
关键词：邻苯二甲酸酯；荧光定量ＰＣＲ；核酸外切酶
中图分类号：Ｘ８２６；Ｘ５６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0823-04
邻苯二甲酸酯（Ｐｈｔｈａｌａｔｅｓ）是塑料的增塑剂，用于增大产品的可塑性和提高产品的强度［１］。随着塑料工业的迅速发展和塑料制品的广泛应用，这类污染物已大量进入环境，普遍存在于土壤、底泥、水体、生物、空气及大气降尘物等环境中［２，３］，对环境的不利影响也逐渐凸显。研究表明，邻苯二甲酸酯具有急性毒性、致癌性和致畸性等多种生物毒性［４－６］，而且邻苯二甲酸酯水解和光解速率都非常缓慢，已成为一种全球性的环境有机污染物，被中国环境检测总站和美国ＥＰＡ列为优先控制污染物［７］。
目前，邻苯二甲酸酯的检测方法包括：气相色谱法［８］、液相色谱法［９］、气相色谱－质谱联用法（ＧＣ－ＭＳ）［１０］以及荧光法［１１］等。由于这类方法检测成本高，操作复杂，分析时间长，因此不利于对环境样品的快速分析。
近年来，随着生物技术的发展，利用具有高灵敏度的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检测技术检测邻苯二甲酸酯正逐渐受到关注。目前，ＰＣＲ技术主要用于检测邻苯二甲酸酯的雌激素效应［１２－１５］，而直接用于检测环境样本中邻苯二甲酸酯含量的研究报道较少。
邻苯二甲酸酯作为雌激素受体的配体，能够与雌激素受体结合并能诱导雌激素受体介导的基因表达，其作用过程为：邻苯二甲酸酯与细胞膜或细胞质中的雌激素受体结合，然后这种结合体迁移到细胞核并与核内ＤＮＡ上雌激素反应位点结合，上行调节雌激素响应基因的转录和翻译，翻译产物蛋白质进入相应的靶组织或靶器官，从而引起雌激素效应［１６］。根据此原理，建立检测邻苯二甲酸酯的核酸外切酶保护－荧光定量ＰＣＲ分析方法。用邻苯二甲酸酯诱导雌激素受体与特异性的双链ＤＮＡ结合，游离的ＤＮＡ被Ｓ１核酸酶降解，以酶切产物作为模板，进行荧光定量ＰＣＲ反应。由于传统的酶切保护分析方法［１７］灵敏度低，假阳性率高。本试验在传统酶切保护基础上，进一步利用Ｓ１核酸酶完全切除ＥｘｏⅢ酶切后留下的单链，使游离的ＤＮＡ不能被扩增，并结合ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ技术对水样中ＰＡＥｓ含量进行检测。
１材料与方法
１．１试剂
邻苯二甲酸二甲酯，ＰＣＲ试剂盒，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ＰＣＲ ｍｉｘ，核酸外切酶ＥｘｏⅢ，Ｓ１核酸酶，其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产。
主要实验仪器包括ＵＶ－２０００紫外分光光度计、Ｒｏｔｏｒ－ｇｅｎｅ ３０００荧光定量ＰＣＲ仪、ＤＹＹ－１１型电泳仪（北京市六一仪器厂）、Ｔａｎｏｎ－２５００Ｒ数码凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）。
１．２引物设计
利用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０引物设计软件设计含有雌激素反应位点的上下游引物，由上海英骏生物科技有限公司合成。引物序列如下：上游引物Ｒ１： ５′ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＧ ３′；下游引物Ｒ２： ５′ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＧ ３′。下划线标明了雌激素反应位点，模板为稀释５０倍后的ｐＵＣ１９质粒［１８］。
１．３方法
１．３．１含有受体细胞溶质的提取取体长为１２ ｃｍ左右的鲤鱼（２０尾），用含０．０５ ｍｇ／Ｌ的邻苯二甲酸酯的水喂养两周后，取鱼肝脏，用冰上预冷的０．１５ ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液去除肝脏外血液后，吸干其表面水分，按照ｍ（肝脏，ｍｇ）∶ｖ（缓冲液，ｍＬ）＝１∶４的比例加入ＨＥＤＧ缓冲液（冰上预冷）后匀浆。匀浆液于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｈ，收集上清，即为含有雌激素受体的细胞溶质，分装后于－８０ ℃保存备用。
１．３．２ 结合ＤＮＡ的制备每５０ μＬ扩增体系中包含：灭菌双蒸水３６ μＬ、ｐＵＣ１９质粒模板工作液２ μＬ、１０倍ＰＣＲ缓冲液５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的四种核苷酸的混合物（ｄＮＴＰｓ）１ μＬ、上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各２ μＬ、２ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶２ μＬ。常规ＰＣＲ循环步骤：预变性９４℃、５ ｍｉｎ；变性９４ ℃、３０ ｓ；退火５８ ℃、４０ ｓ；延伸７２ ℃、４０ ｓ；循环３０次，最终延伸７２ ℃、５ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物于质量分数为１％的琼脂糖凝胶电泳分离，用ＰＣＲ产物快速纯化试剂盒纯化回收。
１．３．３配体－受体－结合ＤＮＡ复合物的制备与酶切将１ ｇ／Ｌ的ＰＡＥｓ按１０倍比稀释为1.0×１0-1 ｇ／Ｌ～1.0×１0-9 ｇ／Ｌ，各取１０μＬ，加入细胞溶质２５０ μＬ，于２０ ℃振荡温育２ ｈ。加入０．２ ｍＬ质量分数为６０％的羟基磷灰石（ＨＡＰ）混匀，冰浴３０ ｍｉｎ， 在４℃以３ ５００ ｒ／ｍｉｍ离心１ ｍｉｎ，弃上清。上述沉淀中加入１ ｍＬ含质量分数为０．０５％ Ｔ－８０的ＨＥＤＧ缓冲液，同条件离心１５ ｍｉｎ，重复３次，最后1次弃上清，加入０．２ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液０．４ ｍＬ，间歇振荡３次，离心１５ ｍｉｎ，取上清，即为配体－受体复合物。
从上述不同浓度配体－受体复合物中，每管取出２０ μＬ于１．５ ｍＬ小管中，加入２ μＬ结合ＤＮＡ，继续２０℃温育１５ ｍｉｎ，此时溶液中为配体－受体－结合ＤＮＡ复合物。
酶切步骤：从上述配体－受体－结合ＤＮＡ复合物中各取１２ μＬ于１．５ ｍＬ小管中，加入２ μＬ ＥｘｏⅢ核酸外切酶缓冲液，６ μＬ Ｈｅｐｅｓ缓冲液，使总体积为２０ μＬ，混匀后３７℃温育１５ ｍｉｎ；每管再加入ＥｘｏⅢ １００ Ｕ，混匀后于３７℃温育１５ ｍｉｎ；按照体积比为１∶３的比例，加入Ｓ１核酸酶（２ Ｕ／μＬ）混合液，３７℃温育３０ ｍｉｎ；再各加入４ μＬ Ｓ１核酸酶终止液，７０℃灭活１０ ｍｉｎ，得到荧光定量ＰＣＲ的模板。
１．４荧光定量ＰＣＲ条件
每２０ μＬ体系中包含ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １０ μＬ（ＭｇＣｌ２最佳质量浓度为２ μｍｏｌ／Ｌ）、上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ、配体－受体结合ＤＮＡ复合物酶切产物作为模板２．５ μＬ、灭菌双蒸水５．５ μＬ。荧光定量ＰＣＲ循环步骤：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ，９４ ℃变性３０ ｓ，５８℃退火４０ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，循环４０次，最后在７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。
２结果与分析
２．１结合ＤＮＡ的凝胶电泳分析
常规ＰＣＲ扩增后产物于质量分数为１％的琼脂糖凝胶电泳分析（图１）。结合ＤＮＡ为长度１ ０２４ ｂｐ的双链ＤＮＡ，与设计的双链ＤＮＡ长度相符。用ＰＣＲ产物快速纯化试剂盒纯化回收后，用紫外分光光度法测得ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ值为１．８６，表明回收ＤＮＡ纯度高。
２．２配体－受体复合物的ＳＰＲ鉴定
表面等离子体共振（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）技术具有免标记、实时在线检测、高灵敏度、非破坏性及高选择性等优点［１８］。本试验采用ＳＰＲ定性鉴定雌激素受体蛋白与邻苯二甲酸酯结合情况（图２、３）。
随着复合物中加入邻苯二甲酸酯配体浓度的增加，配体－受体复合物的ＳＰＲ响应强度增强。在加入邻苯二甲酸酯浓度在1.0×10-9～１.0 ｇ／Ｌ范围内，邻苯二甲酸酯配体浓度与受体－配体复合物的ＳＰＲ响应强度之间基本呈线性关系。说明在此浓度范围内，加入含雌激素受体的细胞质为２５０ μＬ时，邻苯二甲酸酯可与雌激素受体结合。
２．３不同浓度邻苯二甲酸酯诱导结合ＤＮＡ的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ
以不同浓度的邻苯二甲酸酯制备的配体－受体－结合ＤＮＡ复合物，经过外切酶保护处理，作为荧光定量ＰＣＲ模板进行扩增，扩增曲线见图４和图５。邻苯二甲酸酯配体质量浓度Ｃ（ｇ／Ｌ）对数与Ｃｔ值具有线性关系，两者关系式为Ｃｔ＝－０．２７３*ｌｏｇ（Ｃ）＋６．３２０，Ｒ２＝０．９９４ ８，本方法对邻苯二甲酸酯的检出限为１０－１０ ｇ／Ｌ，在低浓度水平下，Ｃｔ并未出现显著变化。
本试验的受试水样来源于松江东华大学北侧的张家浜河河水，样本经过预处理后进行检测，结果如图６所示，其线性检测范围为１０～１００ μｇ／ｍＬ。
２．４特异性分析
将多氯联苯和双酚Ａ代替邻苯二甲酸酯后，按１．４中所述方法进行荧光定量ＰＣＲ扩增，未发现扩增信号，表明多氯联苯和双酚Ａ并没有与受体结合，而邻苯二甲酸酯能与受体结合，说明此方法特异性较好。
２．５加标回收分析
用不含邻苯二甲酸酯的水样进行加标回收试验。加标回收结果见表１。由结果可知，回收率为８１．６％～９７．６％，相对标准偏差为２．６９％～４．４５％。由表１可以看出，本文建立的外切酶保护－荧光定量ＰＣＲ方法准确度高，可以较好地应用于环境中邻苯二甲酸酯的检测。
３结论
建立了一种利用外切酶保护－荧光定量ＰＣＲ检测方法，用Ｓ１核酸酶完全切除核酸外切酶ＥｘｏⅢ酶切后留下的单链，使游离ＤＮＡ完全不能被ＰＣＲ扩增出来，提高了灵敏度。以配体－受体－ＤＮＡ复合物为模板进行ＰＣＲ扩增，当配体－受体－ＤＮＡ复合物中加入的邻苯二甲酸酯质量浓度在１０－９～１０－１ ｇ／Ｌ范围内时，邻苯二甲酸酯对数浓度与Ｃｔ值线性关系为Ｃｔ＝－０．２７３ｌｇ（Ｃ）＋６．３２０。水样样本的检测范围达１０～１００ μｇ／ｍＬ。该方法可同时处理多个样品，且灵敏度高，准确性好，抗干扰性强，检测过程仅２~３ ｈ，为高通量快速检测环境样品中的邻苯二甲酸酯提供了新方法。