【摘要】 目的：探讨儿童肺炎支原体感染的快速、简便、有效的临床实验室诊断方法。方法：对2016年12月收集的200例临床呼吸道感染患儿的咽拭子和静脉血样本进行肺炎支原体快速鉴定培养镜检、抗体检测、抗原检测及荧光定量PCR（Polymerase chain reaction）分析。以快速培养鉴定镜检法为诊断肺炎支原体感染金标准，比较抗体检测、抗原检测及荧光定量PCR三种诊断方法的灵敏度、特异度和Youden指数（正确诊断指数）。结果：抗体檢测的灵敏度、特异度和Youden指数分别为76.3%、77.9%、54.2%；抗原检测为37.7%、89.5%、27.2%；荧光定量PCR为93.0%、96.5%、89.5%。荧光定量PCR法的灵敏度、特异度和Youden指数均高于抗体检测和抗原检测法（P<0.05），三者Youden指数两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异度和Youden指数，可以在未来替代快速鉴定培养镜检、抗体检测和抗原检测法，作为临床诊断儿童肺炎支原体感染的快速、简便而有效的实验室诊断方法。
【关键词】 肺炎支原体； 抗体检测； 抗原检测； 荧光定量PCR
【Abstract】 Objective：To explore the fast，simple and effective method to clinical diagnosis of mycoplasma pneumonia infection of children.Method：Throat swabs and venous blood samples were obtained from 200 children with respiratory infection，these samples were tested by rapid identification culture and microscopy，antibody detection，antigen detection，fluorescence quantitative PCR in December 2016.Rapid identification culture and microscopy was set as the diagnostic “gold standard”，sensitivity，specificity and youden index of three methods were compared.Result：The sensitivity，specificity and youden index of antibody detection were respectively 76.3%，77.9% and 54.2%；antigen detection were respectively 37.7%，89.5% and 27.2%；fluorescence quantitative PCR were respectively 93.0%，96.5% and 89.5%.The sensitivity，specificity and youden index of fluorescence quantitative PCR were higher than those of antibody detection and antigen detection（P<0.05），compared youden index of three methods，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The sensitivity，specificity and Youden index of fluorescence quantitative PCR are higher，it can take the place of rapid identification culture and microscopy，antibody detection and antigen detection in the future，and it is a rapid，convenient and effective laboratory diagnosis method to clinical diagnosis Mycoplasma pneumoniae infection of children.
【Key words】 Mycoplasma pneumoniae； Antibody detection； Antigen detection； Fluorescence quantitative PCR
First-author’s address：Haicang Hospital of Xiamen，Xiamen 361026，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.017
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一种大小介于细菌和病毒之间，缺乏细胞壁，能利用人工培养基生长繁殖的原核细胞型微生物，是人类支原体肺炎（M.pneumoniae pneumonia，MPP）的病原体。MP主要经飞沫传播，潜伏期2～3周，易感人群主要为儿童和青少年[1-3]。国内外多项研究表明，MP的感染发病率从0.6%～47%不等，占儿童社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）病原体的70%左右。随着大环内酯类抗菌药物的广泛应用，其耐药性有所增加，甚至出现了耐药株。有效而灵敏的实验室诊断方法是诊断MP感染的主要依据。目前，国内大多医院对MP感染的诊断，依旧停留在典型的临床感染症状结合血常规及MP抗体检测或MP培养进行诊断的水平。近年来，荧光定量PCR（Fluorescencd quantitative PCR，FQ-PCR）和抗原检测诊断MP感染虽已在临床科研中少量使用，但大多医院并未广泛应用[4-6]。在国外，PCR基因诊断已作为临床诊断的一种常用手段，以FQ-PCR为主。
本研究采用MP快速鉴定培养镜检、ELISA抗原检测、被动凝集抗体检测和FQ-PCR对2016年12月收治的200例患儿进行MP检测，并以快速鉴定培养镜检为MP感染诊断的金标准对抗体检测、抗原检测、FQ-PCR三种方法进行方法学评价，探讨适合MP感染早期快速、简便而有效的诊断方法，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 选取2016年12月就诊于厦门市海沧医院儿科的0～10岁未使用抗菌药物治疗的CAP患儿，且在发病前三个月内无呼吸道感染症状或血常规及胸片等相关检查不支持呼吸道感染。男100例，女100例，男∶女=1∶1，平均年龄（4.87±1.21）岁。CAP诊断依据中华医学会呼吸病学分会2006年制定的诊断和治疗指南标准。
1.2 仪器和试剂 （1）ABI7500 Fast实时荧光定量PCR系统（美国ABI公司）；（2）KDC-2046台式低温离心机（中国科大创新公司）；（3）超低温冰箱（日本SANYO公司）；（4）恒温培养箱（德国贺利氏公司）；（5）酶标仪（美国BIO-RAD公司）；（6）洗板机（上海新波生物技术有限公司）；（7）生物安全柜（中国东联哈尔公司）；（8）平板混合器（江苏金坛仪器厂）；（9）光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；（10）肺炎支原体抗体（MP-Ab）检测试剂盒（日本富士瑞必欧公司）；（11）人肺炎支原体抗原（MP-Ag）检测试剂盒（上海卡迈舒生物科技公司）；（12）肺炎支原体快速鉴定培养试剂盒（陕西百盛园生物科技公司）；（13）肺炎支原体核酸检测试剂盒（杭州艾康生物技术公司）；（14）革兰染色液试剂盒（英国贝索公司）。
1.3 方法 对初次就诊的200例呼吸道感染患儿采集的双份咽拭子分别进行MP快速鉴定培养镜检和FQ-PCR，在患儿出现临床症状1周后，抽取静脉血进行抗原检测和抗体检测。
1.4 觀察指标 采用前瞻性实验性研究，以快速鉴定培养镜检为诊断MP感染金标准，通过灵敏度、特异度和Youden指数来评价抗体检测、抗原检测和FQ-PCR三种实验室方法的诊断价值。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；Youden指数=灵敏度+特异度-1。
1.5 质量控制 以标准株MP129为阳性对照，复溶后培养基为阴性对照。每批测试均设阴阳性对照。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，计数资料以率（%）表示，比较采用U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 200例患儿实验室检查结果 MP快速鉴定培养镜检114例（57.0%），FQ-PCR法109例（54.5%），抗原检测52例（26.0%），抗体检测106例（53.0%），见表1。
2.2 三种实验室诊断方法灵敏度、特异度和Youden指数比较 FQ-PCR法灵敏度、特异度和Youden指数均高于MP-Ab和MP-Ag法（P<0.05）。MP-Ab法具有适中的灵敏度、特异度和Youden指数，而MP-Ag法虽具有较高的特异度，但其灵敏度和Youden指数在三种方法中最低，见表2。
3 讨论
呼吸道感染是儿童时期最为常见的一种疾病，是导致儿童死亡的主要病因[7]。在引起呼吸系统感染的致病菌中，肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是最为常见的一种病原体，流行病学研究显示有50%左右的社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）都是由MP感染引起的[8]。儿童是MP感染的高危人群，多数临床研究表明，MP感染不仅可引起急重型的双侧肺炎及哮喘，还可导致肝功能损伤、免疫性溶血性贫血、脑膜炎、胸膜炎、心肌心包炎、肾炎等多种肺外并发症，且儿童免疫力低，语言表达差，病程发展有时难以预料，严重时可引起多脏器功能衰竭，甚至危及生命[9-10]。MP感染很难从临床表现及症状方面与细菌、衣原体、病毒等其他病原体感染进行鉴别，而MP感染在临床治疗上与其他病原感染治疗方案又有所不同，因此针对儿童MP感染的早期快速诊断显得尤为重要。
MP的实验室诊断还存在诊断标准不一，缺乏敏感且特异的诊断方法等问题。传统的MP培养被认为是诊断MP感染的金标准，但MP分离培养营养要求高，培养时间长，相对不敏感，已不适于临床对MP的快速诊断要求，近年来出现了改良的MP快速鉴定培养，此方法最快可在24 h得到初步检测结果，但需要排除细菌及真菌引起的假阳性结果。目前，临床应用较广的实验室诊断方法是MP抗体检测，虽然MP抗原检测已出现商品化试剂盒，但其还未完全成熟，至今未大量应用于临床。FQ-PCR对MP检测近年来在国内少数大型医院得到应用，是诊断MP感染的新技术之一，具有特异性好，灵敏度高，快速简便的优点[11-15]。
本研究以MP快速鉴定培养结合镜检排除假阳性结果做为诊断MP感染的金标准，对抗体检测、抗原检测和FQ-PCR三种MP诊断方法进行方法学评价。200例呼吸道感染患儿的检测结果显示，针对血清样本的MP抗原检测灵敏度和Youden指数低于抗体检测和FQ-PCR法，其原因除MP抗原检测方法本身敏感性低外，还与病原体侵入血流后易被清除，致使最佳抗原检测时期不易掌握，以及多数情况下MP感染仅侵犯呼吸道黏膜而未侵入血流有关。但血样本MP抗原检测阳性对MP诊断和治疗具有重要意义，是病原体已侵入血流的标志，故可以作为衡量疾病发展严重程度的一个指标，故对临床治疗具有一定的指导作用[16-18]。
MP抗体检测法灵敏度、特异度和Youden指数较FQ-PCR法低，但在灵敏度和Youden指数上高于抗原检测法，主要原因可能为MP感染多起病缓慢，潜伏期达2～3周，而且儿童个体间的机体免疫状态存在差异，多数患儿在MP感染1周后，血清抗体效价能达到阳性水平，且多在15 d达到高峰，但还有部分患儿抗体效价升高缓慢或不升高，达不到阳性检出水平。因此，抗体检测法对MP感染早期患儿以及免疫系统发育缺陷和未成熟的婴幼儿，由于相应抗体未产生或产生少而使检测结果常呈现阴性，已难以满足临床对急重性MP感染患儿早期、快速诊断的需要。抗体检测法对临床实验室设备、技术条件及人员素质要求不高，亦可诊断MP既往感染，以其适中的敏感度（76.3%）、特异度（77.9%）和Youden指数（54.2%），在临床应用中仍然具有很高的诊断价值。且此方法与FQ-PCR法相比试剂成本低，非常适合于MP感染的常规筛查，其检测结果也得到医务人员和患者家属的接受和认可，故现阶段还无法在短期内被全面取代。目前，在国内大中医院中，抗体检测仍是应用最为广泛的诊断MP感染的实验室方法。
FQ-PCR法的灵敏度、特异度和Youden指数均高于MP抗原检测和抗体检测，分别达到93.0%、96.5%和89.5%。分析其原因，主要是因为FQ-PCR法与培养法同是直接对呼吸道黏膜表面的病原体进行检测，且所需样本量少，检测量可达到1×103/mL[19]。本研究中FQ-PCR法出现8例假阴性结果，分析原因可能为：（1）采集患儿咽拭样本时，由于患儿存在恐惧心理不配合采样致样本采集存在量的差异；（2）样本在运输及检测操作过程存在人为误差造成假阴性结果。同时本法还出现了3例假阳性结果，分析原因可能为：（1）样本采集、运输及处理过程中的操作误差所造成的差异性；（2）FQ-PCR法是对MP进行核酸检测，无论病原体死活均可检出，而培养法仅能对活体进行检测。
相对于传统的MP培养法以及近年来改良的快速培养法，FQ-PCR法可以对MP进行快速、微量检测，4 h内即可发出检测报告。相对于抗体检测、抗原检测等血清学方法又具有灵敏度高，特异性好的优点，MP感染早期即可进行明确而有效的诊断，对MP携带和隐性感染者具有较高的检出率，非常适合儿童急重性MP感染早期的临床诊断[20]。
正因为FQ-PCR法具有在MP感染早期即可做出快速、及时、准确诊断的优点，大大简化了诊疗程序，使MP感染患儿特别是急重性患儿能够得到及时有效的确诊并治疗，从而减少了患儿病发症的发生，缩短了病程。目前此方法试剂成本较高，在一定程序上限制了其在临床中的推广应用，但随着技术的成熟及在国内医疗机构的普及，其成本会逐渐降低并为患者家属所接受，并最终替代血清学方法和培养法作为MP感染更快速、简便而有效的实验室诊断方法。
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（收稿日期：2017-05-11） （本文编辑：鄧朝阳）