摘要:通过对HIF-2a/EPAS1基因多态性与HiHiLo训练前后血象指标进行关联分析,以期筛选预测HiHiLo实施过程中血象指标变化的分子标记。(1)对72名健康受试者进行4周的HiHiLo训练,在实验前后测量血象指标。(2)采用PCR-RFLP方法对HIF-2a/EPAS1基因多态位点进行解析。(3)对HIF-2a/EPAS1基因多态性与HiHiLo训练前后血象指标进行关联分析,探寻HiHiLo训练中评价血象效果的分子遗传学标记。结果发现:(1)WBC变化量在不同基因型之间差异存在显著性的趋势(P<0.10),M Retic#变化量差异存在显著性。(2)MCV、MCH变化量在rs6715787多态位点不同基因型之间差异存在显著性(P<0.01、P<0.05)。结果说明:(1)HIF-2a/EPAS1基因rs7598371多态位点与HiHiLo训练前后WBC和M Retic#相关联,可以作为HiHiLo训练中预测WBC和M Retic#变化的分子标记。(2)HIF-2a/EPAS1基因rs6715787多态位点与HiHiLo训练前后MCV和MCH相关联,可以作为HiHiLo训练中预测MCV和MCH变化的分子标记。
关键词:运动生物化学;高住高练低训;低氧诱导因子2基因;分子标记;血象指标
中图分类号:G804.7文献标识码:A文章编号:1006-7116(2010)06-0096-06
From the HIF-2a gene screening out molecular markers that predict the changing of hemogram indexes during the implementation of HiHiLo
JIN Xi1,HU Yang1,LUO Dong-mei2,LI Yan-chun1,YI Long-yan1
(1.Sport Science Research Center,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;
2.Department of Anatomy,Beijing Sport University ,Beijing 100084,China)
Abstract: The authors intended to screen out molecular markers that predict the changing of hemogram indexes during the implementation of HiHiLo by analyzing the correlation between the polymorphism of the HIF-2a/EPAS1 gene and hemogram indexes before and after HiHiLo training. 1) the authors carried out 4-week HiHiLo training on 72 healthy testees, and measured hemogram indexes before and after the experiment; 2) the authors dissected the polymorphic loci of the HIF-2a/EPAS1 gene by applying the PCR-RFLP method; 3) the authors analyzed the correlation between the polymorphism of the HIF-2a/EPAS1 gene and hemogram indexes before and after HiHiLo training, and probed into molecular genetic markers for evaluating hemogram effects during HiHiLo training. The authors revealed the following findings: 1)there was a significant difference between WBC changes in different genotypes (P<0.10), and there was a significant difference between M Retic# changes; 2)there was a significant difference between MCV and MCH changes at the rs6715787 polymorphic locus in different genotypes (P<0.01, P<0.05). The said findings indicated the followings: 1)the rs7598371 polymorphic locus of the HIF-2a/EPAS1 gene is correlative with WBC and M Retic# before and after HiHiLo training, can be used as a molecular marker to predict WBC and M Retic# changes during HiHiLo training; 2)the rs6715787 polymorphic locus of the HIF-2a/EPAS1 gene is correlative with MCV and MCH before and after HiHiLo training, can be used as a molecular marker to predict MCV and MCH changes during HiHiLo training.
Key words: sports biochemistry;HiHiLo;HIF-2a/EPAS1 gene;molecular marker;hemogram index
在哺乳动物体内细胞中存在一类介导低氧适应性反应的转录因子,它能激活许多低氧反应性基因的表达,是在低氧条件下维持氧稳态的关键性物质,称为低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)[1]。从1992年发现HIF-1a以来,学者们对其做了大量的研究,首先探讨的是在低氧中的各种反应及其机制,于1997年由Tian等人在内皮细胞中发现了HIF-2a(命名为“内皮PAS区蛋白1”即EPAS1)。
HIF-2a/EPAS1调节许多基因,包括主动脉体中的酪氨酸羟化酶和活体Ⅱ型肺泡细胞中的VEGF。Norihiko Takeda等[2]发现,HIF-2a/EPAS1促进Flt-1基因的表达,并且诱导VEGF、Flk-1(Vascular Epidemal growth factor receptor-1,血管内皮生长因子受体1)和Tie2(血管生成素受体)mRNA的表达,这提示HIF-2a/EPAS1在血管生成中起到了重要的作用。同时,Hirota K、Gruber M等[3-4]研究发现,HIF-2a/EPAS1是EPO合成的主要调节物,且Rankin EB等[5]认为在肝脏内,EPO水平优先由HIF-2a/EPAS1调控。Melanie JP等[6]结合先前的研究表明PHD2-HIF-2A-VHL途径是在人体内调节EPO产生的核心分子机制。氧充足时,HIF-2a/EPAS1被脯酰胺羟化酶(PHD2)羟化,使得与VHL蛋白结合,HIF-2a/EPAS1之后成为蛋白酶体的目标。当低氧时,HIF-2a/EPAS1不再被脯酰胺羟化酶(PHD2)羟化,而是与靶基因的低氧反应元件(HRE)结合[7]。EPO就是靶基因之一,它的产生增加了红细胞的数量,从而提高了机体的携氧能力,更有利于机体的运动。Chapman RF等[8]研究发现,在海拔2 500 m暴露30 h后,低氧敏感者源于血清EPO的显著升高而导致红细胞数和最大摄氧量的增加。低氧非敏感者虽EPO得到升高,但红细胞数却没有改变。因此,目前对于高原训练首要解决的问题就是个体差异性,即根据不同个体对高原低氧反应的敏感性来有针对性地制定个性化训练方案。由于HIF-2a/EPAS1在血管发生中所起的必不可少的作用,本研究拟采用PCR-RFLP技术,对HIF-2a/EPAS1基因多态性进行分析,探讨其与HiHiLo训练前后血象指标变化的关联性,为预测HiHiLo实施过程中血象指标变化提供分子标记。
1研究对象与方法
1.1研究对象
选取北京体育大学在校男学生72人,年龄(21.10±1.37)岁,身高(177.93±5.26) cm,体重(69.80±7.80) kg,运动年限(4.29±2.12)年。分别来自山东、河北和东北三省、内蒙古河套地区等中国北方平原地区,所有受试者中无世居高原者,且实验前6个月内均无高原居住史,身体健康。
1.2HiHiLo训练方法
1)HiHiLo训练方案:受试者低氧睡眠+低氧训练+常氧专项训练,共30 d。低氧睡眠每周7 d,每晚至少10 h(晚21:00～次日晨07:00),氧体积分数为14.8%～14.3%(模拟海拔高度约2 800～3 000 m);低氧训练每周3次,低氧训练方式为常压低氧环境(氧气体积分数为15.4%～14.8%,模拟海拔高度约为2 500～2 800 m)蹬功率自行车30 min(60 rpm/min),以个体75%VO2max强度为基础,运动过程中调节功率车负荷使受试者SpO2维持在87%～93%范围。
2)血象指标的测试:分别在HiHiLo训练第1天和第30天取样,晨起安静空腹状态下取受试者静脉血,交由北京体科所进行测试,测试指标包括:RBC(红细胞)、HCT(红细胞压积)、HGB(血红蛋白)、Retic(网织红细胞)、WBC(白细胞)、MCV(红细胞平均体积)、MCH(平均红细胞血红蛋白量)、MCHC(平均血球血红蛋白浓度)、CH(红细胞血红蛋白含量)、CHDW(红细胞血红蛋白分布宽度)、RDW(红细胞平均分布宽度)、HDW(血红蛋白分布宽度)、MPV(血小板体积)、M Retic#(中荧光网织红细胞计数)、MCVr(网织红细胞平均体积)、CHCMr(单个网织红细胞平均血红蛋白浓度)、CHr(网织红细胞血红蛋白含量)、Macro%(大红细胞百分比)、Hypo%(低色素红细胞百分比)等。
1.3基因多态性分析实验
1)多态位点的选择方法:HIF-2a/EPAS1在已有的关联研究中很少提到,仅发现Jennifer Henderson等人做过HIF-2a/EPAS1 基因多态性在优秀耐力运动员中有氧与无氧的研究,但其多态位点均由ABI公司提供,参考NCBI数据库中NT_022184.14序列,通过Hapview软件选择出3个标签SNP,即rs13419896、rs7598371、rs6715787作为多态性分析位点。
(1)rs13419896多态位点:该多态位点位于1号内含子,杂合度=0.324。Hapview分析表明该位点是标签SNP,标签:rs11125071、rs6758592、rs4953348、rs7582701、rs10193827、rs9679290、rs4952819、rs4953343、rs4953342、rs7598371。
(2)rs7598371多态位点:该多态位点位于11号内含子,杂合度=0.364。Hapview分析表明该位点是标签SNP,标签:rs11690951、rs13019268、rs7594278、rs13006131、rs11694193。
(3)rs6715787多态位点:该多态位点位于2号内含子,杂合度=0.496。Hapview分析表明该位点是标签SNP,标签:rs4953360、rs17035013、rs17035010、rs6712143、rs6743087、rs7583554、rs2278753、rs6755594、rs7589621。
2)基因分型方法:HIF-2a/EPAS1基因多态位点引物的设计与合成参考NT_022184.14序列,应用primer5.0自行设计引物,采用PCR-RFLP进行基因多态性分析,引物由上海生工生物工程有限公司合成。
(1)rs13419896多态位点的分型方法:
引物:上游:5" TTCCCTGTTCCCTCCTCCTTT 3";下游:5" TCCTACCCTGTGGTTGCCTCG 3"。
PCR反应体系(15 μL):DNA模板0.4 μL、Taq酶(0.3 μL,5 U/μL)、dNTP(0.4 μL,10 mmol/L)、Mg2+(1.2 μL,25 mmol/L)、上下游引物(各2 μL,5 µ mmol/L)、PCR buffer 2 μL,灭菌双蒸水补齐。
PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;变性94 ℃ 30 s,退火66.5℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。
PCR反应产物:373 bp,产物通过2%的琼脂糖电泳检验。
酶切条件:PCR产物3.5 μL,内切酶HaeII:0.2 µL,10 U/µL;37 ℃水浴3～4 h。
酶切产物:373/306/66 bp。2%的琼脂糖电泳分型。
(2)rs7598371多态位点的分型方法:
引物:上游:5"CAGGTAGATGGCTGTGGA3"
下游:5"AGTGGTATCATTTCGGTTTT3"
PCR反应体系(15 μL):DNA模板0.4 μL、Taq酶(0.3 μL,5 U/μL)、dNTP(0.4 μL,10 mmol/L)、Mg2+(1.0 μL,25 mmol/L)、上下游引物(各2 μL,5
µ mol/L)、PCR buffer 2 μL,灭菌双蒸水补齐。
PCR反应条件:95 ℃预变性10 min;变性95 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。
PCR反应产物:272 bp,产物通过2%的琼脂糖电泳检验。
酶切条件:PCR产物3.5 μL,内切酶TaqI:0.2μL,10 U/µL,TaqI Buffer:0.8;65 ℃水浴2～3 h。
酶切产物:272/222/50 bp。2%的琼脂糖电泳分型。
(3)rs6715787多态位点的分型方法:
引物:上游:5" TCAGTTGAGCATCCCTAACCC3"
下游:5" CCAGCCCTTGTCAGCATCTTT3"
PCR反应体系(15 μL):DNA模板0.4 μL、Taq酶(0.2 μL、5 U/μL),dNTP(0.4 μL、10 mmol/L)、Mg2+(0.6 μL,25 mmol/L)、上下游引物(各2 μL,5
µ mol/L)、PCR buffer 2 μL,灭菌双蒸水补齐。
PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;变性94 ℃ 30 s,退火60.7 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。
PCR反应产物:359 bp,产物通过2%的琼脂糖电泳检验。
酶切条件:PCR产物3.5 μL,内切酶ECORI:0.2 μL,10 U/µL,Buffer ECORI:0.8;37 ℃水浴2～3 h。
酶切产物:359/261/98 bp。2%的琼脂糖电泳分型。
1.4数据统计
数据由SPSS13.0 for Windows软件包进行统计分析,数据以平均值和标准差( ±s)表示。采用卡方检验(Chi-Square,χ2)以确认所选人群不同基因型的分布是否符合基因平衡定律(Hardy-Weinberg,H-W平衡),以检验是否具有群体代表性,显著性水平为P<0.05。不同基因型之间各指标实验前的基础值采用独立样本T检验,不同基因型之间各指标训练敏感性的差异以基础值为协变量,采用协方差分析。显著性差异定为P<0.05,极显著性差异定为P<0.01。
2结果及分析
2.1HIF-2a/EPAS1基因多态位点解析
1)HIF-2a/EPAS1 rs13419896多态位点解析。
HIF-2a/EPAS1 rs13419896多态位点经PCR扩增后得到片断长度为373 bp的条带产物,PCR产物经HaeII内切酶消化后通过2%琼脂糖电泳得到3条带:有酶切位点的纯合型GG(66、306 bp),没有酶切位点的纯合型AA(373 bp)和杂合型AG(306、66、373 bp)(如图1)。
基因型经χ2检验,χ2=3.29,P>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡定律,即本研究所选的研究对象具有群体代表性。通过基因分型发现,携带AA基因型受试者4人,占5.6%;携带AG基因型受试者38人,占52.8%;携带GG基因型受试者30人,占41.6%。由于AA基因型人数小于5,故将AA基因型与AG基因型合并分析。
2)HIF-2a/EPAS1 rs7598371多态位点解析。
HIF-2a/EPAS1 rs7598371多态位点经PCR扩增后得到片断长度为272 bp的条带产物,PCR产物经TaqI内切酶消化后通过2%琼脂糖电泳得到3条带:有酶切位点的纯合型CC(50、222 bp),没有酶切位点的纯合型GG(272 bp)和杂合型CG(272、50、222 bp)(如图2)。基因型经χ2检验,χ2=2.52,P>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡定律,即本研究所选的研究对象具有群体代表性。通过基因分型发现,携带CC基因型受试者3人,占4.2%;携带CG基因型受试者14人,占19.4%;携带GG基因型受试者55人,占76.4%。由于CC基因型人数小于5,故将CC基因型与CG基因型合并分析。
3)HIF-2a/EPAS1 rs6715787多态位点解析。
HIF-2a/EPAS1 rs6715787多态位点经PCR扩增后得到片断长度为359 bp的条带产物,PCR产物经ECORI内切酶消化后通过2%琼脂糖电泳得到3条带:有酶切位点的纯合型CC(98、261 bp)、没有酶切位点的纯合型GG(359 bp)和杂合型CG(359、261、98 bp)(如图3)。基因型经χ2检验,χ2=0.89,P>0.05,符合Hardy-Weinberg平衡定律,即本研究所选的研究对象具有群体代表性。通过基因分型发现,携带CC基因型受试者3人,占4.2%;携带CG基因型受试者30人,占41.6%;携带GG基因型受试者39人,占54.2%。由于CC基因型人数小于5,故将CC基因型与CG基因型合并分析。
2.2HIF-2a/EPAS1基因多态位点与HiHiLo训练前后血象指标的关联
研究结果表明:rs13419896多态位点在HiHiLo训练前后所有血象指标的变化量在不同基因型之间差异不存在显著性。
rs7598371多态位点在HiHiLo训练前后,WBC指标的变化量在不同基因型差异之间存在显著性的趋势(P<0.10),表现为携带CC+CG基因型的群体在训练后WBC下降,而携带GG基因型的群体在训练后WBC上升。并且在训练后M Retic#的变化量在不同基因型之间差异也存在显著性的趋势(P<0.10),表现为携带CC+CG基因型的群体在训练后M Retic#上升的趋势显著大于携带GG基因型的群体。其他血象指标的变化量在不同基因型之间差异不存在显著性(见表1)。
rs6715787多态位点在训练前后,MCV指标的变化量在不同基因型之间差异存在极显著性(P<0.01),表现为携带CC+CG基因型的群体MCV指标的增加幅度大于携带GG基因型的群体。MCH指标变化量在不同基因型之间差异存在显著性(P<0.05),表现为携带CC+CG基因型的群体在训练后MCH指标的上升幅度大于携带GG基因型的群体,其他血象指标的变化量在不同基因型之间差异不存在显著性(见表1)。
3讨论
本研究发现,在HiHiLo训练前WBC在不同基因型之间差异存在显著性(P=0.10)。张缨等[9]认为,在生理情况下,外周血中白细胞数量可有个体差异。这与本研究结果一致,即在HiHiLo训练后WBC变化量在不同基因型之间差异存在显著性的趋势。有报道表明,HiHiLo训练时,在缺氧环境下运动,机体对免疫功能的影响更加明显。张缨等研究发现,低氧暴露第2周与急性暴露相比白细胞总数非常显著性下降,第3周出现回升,第4周又出现显著性下降。虽然4周高住低训中白细胞总数等指标的变化仍在正常范围内波动,但由于白天训练和晚上低氧暴露的双重刺激,对机体免疫功能的影响比单纯训练或低氧暴露刺激影响更大。同时,随着低氧时间的延长,白细胞数量下降,造血功能受到影响,推测机体免疫功能可能降低,提示HiHiLo训练可能对机体免疫力产生了不利的影响。但是,关于WBC与HIF-2a/EPAS1之间的关联尚未见报道,其中的机制还需深入研究。在本研究发现,WBC变化量在不同基因型之间差异存在显著性的趋势(P=0.10),表现为携带CC+CG基因型的群体在训练后WBC数量降低,而携带GG基因型群体在训练后WBC数量升高,提示携带CC+CG基因型的群体可能更适合HiHiLo训练。因此,可以考虑将rs7598371多态位点作为HiHiLo训练前后WBC指标的分子遗传学标记,以期在HiHiLo训练前后对WBC变化敏感型受试者采取一定的保护措施。
网织红细胞是介于晚幼红细胞与成熟红细胞之间的尚未完全成熟的红细胞,它是反映骨髓造血功能活跃的敏感指标。有研究表明,运动可加速红细胞衰老,使红细胞破坏增多,另一方面,运动又可刺激骨髓造血,从这两方面看,运动增加了红细胞的更新[10]。M Retic#是中荧光网织红细胞的计数,它与高荧光网织红细胞的计数共同反映了红细胞生成的开始,是红系活动性显示的参数。Mairbaurl、Klausen K等[11]研究发现,运动和低氧能够促进EPO的增加,进而增加网织红细胞的生成,也有报道表明,在成年动物中,HIF-2a/EPAS1是HIF-a中调节EPO水平的主要物质。这提示HIF-2a/EPAS1基因在低氧的刺激下,诱导EPO生成,从而使网织红细胞增多,因此M Retic#差异存在显著性,但本研究中,H Retic#差异并无显著性,而高荧光更能反应网织红细胞的幼稚性,且HGB也无显著性差异,可能HIF-2a/EPAS1基因并不在网织红细胞形成初期过程中起作用,仅在形成过程中对其产生作用,其中的机制尚不明确,还需探讨。在HiHiLo训练前后M Retic#(P=0.09)变化量在不同基因型之间差异存在显著性的趋势,表现为携带CC+CG基因型的群体变化量大于携带GG基因型群体,提示携带CC+CG基因型的群体可能对HiHiLo有更高的敏感性,可以考虑将rs7598371多态位点作为HiHiLo实施过程中预测M Retic#变化的分子标记。
MCV表现了红细胞的平均体积,本研究表明,在HiHiLo训练前后,MCV增加,且在不同基因型之间差异具有显著性。Carfo Brgunara[12]研究发现,成熟红细胞体积与网织红细胞体积的比值约为1︰1.3,从一定程度而言,MCV的高低也反映了红细胞的成熟度。运动员长期生活在高原低氧环境中,主要靠增加RBC数目和HGB含量,减小MCV来提高血液携氧和运氧能力的。在一定范围内,RBC数目增多,体积减小,可以扩大红细胞膜的总表面积,有利于红细胞内外氧的交换。然而,运动员高原训练期间,因承受的运动负荷加大,RBC的破坏大于生成,造成MCV升高。惠小阳等[13]观察中长跑一次有氧与无氧训练对血细胞的影响,发现训练前两组间红细胞各项参数变化差异无显著性,训练后RBC和HGB都有一定程度的上升,MCV增大、MCHC减低、MCH变化不大。洪雷[14]对专业运动员进行4周系统训练,其中有氧训练占60%～70%,无氧训练占40%～30%。训练后较训练前HCT、MCV上升,RBC下降,MCHC、MCH下降,认为红细胞的体积增大可能提示红细胞的功能下降。根据临床研究结果发现,溶血使游离血红蛋白增加,导致MCH、MCHC升高。训练或比赛初期,机体对负荷不适应,在血液有形成分中,细胞稳定性降低,RBC减少,MCV、MCH、MCHC异常变化,提示红细胞功能异常。随着运动过程的进展,如果机体对负荷适应了,这些参数会逐渐恢复到安静时状态;如果机体不能适应所承受负荷,这些参数的异常会继续存在,这提示运动性疲劳的发生[15]。以上研究结果表明,MCV的上升很可能与受试者RBC的破坏和功能异常有关,作者认为此结果可能是机体对HiHiLo训练的一种适应。在HiHiLo训练后,MCV的变化量在不同基因型之间差异存在极显著性(P=0.01),表现为携带CC+CG基因型的群体变化量大于GG基因型群体,提示携带GG基因型的群体可能对HiHiLo有更高的敏感性,可以考虑将rs6715787多态位点作为HiHiLo实施过程中预测MCV变化的分子标记。
MCH是红细胞内血红蛋白数量的评价指标。本研究结果表明,高原训练后MCH水平增加,MCH的提高有助于红细胞携氧能力的增强,从而提高耐力。且MCH的变化量在不同基因型之间差异存在显著性,这可能与HIF-2a/EPAS1促进EPO的生成有关,有报道表明EPO是HIF-2a/EPAS1调节的靶基因,在低氧条件下,HIF-2a/EPAS1刺激EPO的表达,EPO又能促进红细胞增加,从而提高了血红蛋白的数量。在本实验中,HiHiLo训练前后MCH的变化量在不同基因型之间差异存在显著性(P=0.04),表现为携带CC+CG基因型的群体变化量大于携带GG基因型的群体,提示携带CC+CG基因型的群体可能对HiHiLo有更高的敏感性,因此,可以考虑将rs6715787多态位点作为HiHiLo训练前后MCH指标的分子遗传学标记。
rs7598371和rs6715787多态位点分别位于11号和2号内含子,尽管不直接参与氨基酸编码,但内含子功能可能会影响mRNA的拼接,从而影响基因序列的转录翻译。有研究表明,HIF-2a/EPAS1基因第2外显子是DNA与异二聚体结合的关键[16]。rs6715787多态位点与第2外显子的距离十分接近,推测由于此多态位点的存在,在一定程度上可能影响了DNA与异二聚体结合,使得HIF-2a/EPAS1诱导其靶基因的表达发生改变,如EPO、VEGF、Flk-1和Tie2等,进而改变了红细胞的生成和血管的形成,最终导致以上所述血象指标在不同基因型之间产生显著性的差异。
4小结
1)HIF-2a/EPAS1基因rs7598371多态位点与HiHiLo训练前后WBC和M Retic#相关联,可以作为HiHiLo训练中预测WBC和M Retic#变化的分子标记。
2)HIF-2a/EPAS1基因rs6715787多态位点与HiHiLo训练前后MCV和MCH相关联,可以作为HiHiLo训练中预测MCV和MCH变化的分子标记。
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