【摘要】 蛋白酶是工业酶中应用最广最多的一类酶，约占酶总量的60%。如在制革工业中，利用蛋白酶制剂对各工序中蛋白质进行处理。此外，在食品、饲料和饵料等生产过程中，蛋白酶被广泛作为各种添加剂使用。比如，在鱼类养殖中，从鱼体消化道筛选出的高产蛋白酶菌株产生的蛋白酶制成的酶制剂可作为饵料（尤其是开口饵料）的添加剂使用，从而弥补人工育苗早期鱼苗因消化道发育尚不完全而导致的酶分泌量的不足，降低育苗过程中鱼类的死亡率，提高其生存率，进而节约育苗成本。因此，在用开口饵料进行苗种培育时， 必须添加益生菌或酶制剂以弥补鱼苗消化酶分泌不足的状况。益生菌是一类具有巨大实用价值的生物工程产品，它是由从宿主体内、水体等分离出的菌群成分制成的活菌制剂，再通过适当途径作用于养殖动物。目前，国内外报道的益生菌主要有乳酸菌（包括乳杆菌和肉杆菌），芽胞杆菌和假单胞菌，其中应用最广泛的是能产生蛋白酶的芽胞菌。
本实验从大菱鲆的肠道中分离出一株能产蛋白酶的菌株，通过对该菌株进行形态学，生理生化和16S rDNA序列分析及其系统发育分析以期更好地了解该菌株和利用该菌株。形态学的鉴定主要是对菌株和菌落的观察，在本实验中利用革兰氏染色和芽胞染色对菌株进行初步的鉴定。在形态学的鉴定基础上该菌株的生理生化鉴定为接触酶，氧化酶和能否利用一些葡萄糖类物质。16S rDNA序列分析及其系统发育分析则能更精确地分析出该菌株的属和科。
【关键词】 蛋白酶 筛选 鉴定
本实验中采用选择性培养和富集培养两种不同的培养方法从大菱鲆肠道中分离筛选出一株水解圈较大的产蛋白酶菌株，并将这株菌株命名为B5。将B5菌株接种到海水琼脂培养上培养24h使菌株活化，之后挑取单菌落进行涂片和革兰氏染色，革兰氏染色的过程为：①取无油迹的干净载波片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。②自然风干，或在火焰上通过几次，固定涂片。③滴加结晶紫液，染一分钟。用水冲净结晶紫液。④滴加碘液，覆盖约1min。用水冲去碘液，将片上的水甩干。⑤滴加95%乙醇液脱色，并立即用水冲净乙醇。⑥番红液染1-2min。用水洗净，风干，用显微镜油镜观察涂片。菌体红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。将B5菌株进行芽胞染色[8]，芽胞染色的过程是：（1）加孔雀绿染液2—3滴于已涂上B5菌株的玻片上，然后加热染色15 min：（2）水冲洗，至到流出的水无绿色为止；（3）用0.5%沙黄液复染2 min，弃去多余的染液，吸水纸吸干镜检（此步骤不用水冲洗）。利用上述的初步鉴定结果参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》（第9版）和常规生理生化鉴定对B5菌株进行以下生理生化分析：氧化酶和接触酶的分析，是否产H2S，甘露醇，葡萄糖和尿素利用。氧化酶试验的过程为：取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深； 再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。接触酶试验过程：将24h培养的斜面菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。产H2S试验的过程：以无菌操作将B5菌穿刺接种至培养基中，并将接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱中培养24h观察结果。甘露醇，葡萄糖和尿素利用试验的方法与产H2S试验的方法相似。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取B5菌株的基因组，细菌基因组DNA的提取过程为：①取细菌培养液lmL，1000Orpm 离心lmin ，尽量吸尽上清。②向菌体沉淀中加入200uL溶液GA，振荡至菌体充分悬浮。③向管中加入2OuL蛋白酶K溶液 ，充分混匀。④向管中加入2OOuL 溶液GB，振荡15s，70℃ 放置3Omin，沉淀即会消失，简短离心除去壁内水珠。⑤向管中加入2OOuL 无水乙醇，充分混匀振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除水珠。⑥将上一步所得的沉淀和溶液都加入到一个吸附柱GB3中，1200Orpm 离心30s，弃废液，将吸附柱GB3放入收集管中。⑦向吸附柱GB3中加入700uL 漂洗液GD，12000rpm 离心30s ，弃废液，将吸附柱GB3放入收集管中。⑧向吸附柱中加入5OOuL 漂洗液PW，1200Orpm 离心30s，弃废液，将吸附柱放入收集管中。⑨向吸附柱中加入5OOuL 漂洗液PW，1200Orpm 离心30s，弃废液，将吸附柱放入收集管中。将吸附柱置于室温放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等。⑩将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50 -2OOuL洗脱液TE，室温放置2-5min，1200Orpm 离心2min，将溶液收集到离心管中。并将收集到的DNA进行16SrDNA的PCR扩增，PCR扩增的反应体系为
10×扩增缓冲液 2.5uL
Dntp 2.5uL
引物1 2uL
引物1 2uL
模板DNA 2uL
Taq DNA聚合酶 2uL
Mg2+ 2uL
雙蒸水 11uL
PCR扩增反应程序为：95℃ 10min （95℃ 1min 55℃ 1min 72℃ 1min）30个循环 72℃延伸10min。扩增结束后进行电泳检测，确定成功后用PCR胶回收试剂盒对扩增产物进行胶回收。胶回收的过程是：⑴将PCR产物转移到一个干净的1.5ml？EP管中，加入3倍体积的结合液，轻轻混匀。⑵将步骤1的混合液加入到吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。⑶加入600uL漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液。⑷再次加入300uL漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液。再以12000rpm离心1分钟。⑸直接加入6-10uL水于吸附柱中，12000rpm离心30秒洗脱DNA。所收集的DNA可进行后续的实验。将回收的PCR产物与合适的质粒载体连接转入感受态细胞中。将转化成功的细胞进行摇床培养，取菌液进行PCR、琼脂糖电泳检测。重组产物送交公司测序。将测序获得的16SrDNA序列在NCBI中运用BLAST软件进行同源性分析，并运用Clustal 1.8软件对同源性高的序列进行比对，用Mega2软件构建系统发育树，并进行系统进化分析。
通过对大菱鲆胃肠道菌的分离和筛选，分离所得一株具有产蛋白酶能力的菌株B5，并对该菌株进行了鉴定。本实验在鉴定过程中运用了细菌形态学鉴定法生理生化鉴定法和16S rDNA序列分析及其系统发育分析鉴定法。细菌形态鉴定法主要包括革兰氏染色和芽胞染色，经染色所知B5菌株为革兰氏阳性和含有芽胞。生理生化鉴定主要内容有氧化酶和接触酶的分析，是否产H2S，甘露醇，葡萄糖和尿素利用，B5菌株为氧化酶阴性，接触酶阳性，能利用甘露醇和葡萄糖，不能利用尿素和不产H2S。16S rDNA序列分析及其系统发育分析鉴定法利用对菌株的16S rDNA序列分析出B5菌株为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus B5。这三种方法都有各自得优缺点，相对来说形态学和生理生化鉴定法只是对菌株进行初步的鉴定。16S rDNA序列分析及其系统发育分析鉴定法不仅能鉴定出为何种菌株，还能列出菌株的进化树使鉴定结果更为精确。