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开放阅读框62抗体）、HECW2（E3泛素蛋白连接酶）、MAP1B（微管相关蛋白）、NHS（NHS肌动蛋白调节因子）、B4GALT6（β-1，4-半乳糖基转移酶）、ATP2A2（肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶）、AP4E1（蛋白复合物接头分子）和BBX（锌指蛋白）;且发现有11条靶基因相关通路，其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路。【结论】广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达，miR-148b存在18个靶基因和11条相关通路，且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相关疾病通路上发挥作用。
关键词： 广西巴马小型猪;miR-148b;慢病毒载体;靶基因;相关通路预测
0 引言
【研究意义】microRNA（miRNA）的发现对药物研发和基础生物医学研究领域产生了巨大影响。miRNA作为一种非编码RNA，是一类进化保守的单链小分子RNA，其长度一般在19～23 nt，调控50%左右的蛋白编码基因，且被证实与很多疾病有关。miR-148是一种新发现的miRNA，属于miR-148/152家族，其家族包括miR-148a、miR-148b和miR-152。miR-148/152家族各成员在很多肿瘤疾病中存在差异表达，肿瘤的生长、增殖、凋亡、血管新生及对药物的敏感性等生物学功能均受其调控影响（王晓雪等，2015）。广西巴马小型猪具有体型矮小、遗传相似性高、与人类相近且遗传稳定性强等特点，是作为相关疾病模型研究的理想实验材料（宋少锐等，2014;张广杰等，2018;黄叶等，2019），因此，制备广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体，并对其靶基因进行预测及相关通路分析，可为揭示miR-148b的作用机制打下基础。【前人研究进展】miR-148a、miR-148b和miR-152因具有相同的种子序列（UCAGUGCA）而被归为同一家族，即miR-148/152家族，具有相近的结构和功能（王晓雪等，2015）。其中，Pre-miRNA 148a定位于基因组7p15.2，属于基因间miRNA，其长度为68 nt;Pre-miRNA 148b定位于基因组12q13.13，为内含子miRNA，长度为99 nt。在大多数肿瘤细胞中，miR-148a通常呈低表达状态（Linhart et al.，2007），如在肝癌细胞SMMC-7721的侵袭和迁移过程中，miR-148a对此具有负调控作用（贾筱琴等，2014）。在胃癌组织中，miR-148a/b起到抑癌基因的作用，因启动子区域的CpG岛异常甲基化而失活，导致其在胃癌组织中呈低表达状态（居峰等，2013）。Chen等（2010）、Ueda等（2010）、Zheng等（2011）研究表明，在体外试验中上调miR-148a/b表达能显著抑制胃癌细胞的迁移能力。李国喜等（2013）研究发现，在鸡胚发育过程中miR-148a的表达呈时序性，且其表达集中在出壳后的发育过程中，为广泛性表达，调控着诸多器官组织的生长发育。居峰等（2013）研究证实miR-148a的甲基化状态与DNA甲基转移酶I（DNMT1）呈正相关。DNA甲基转移酶（DNMTs）是导致CpG岛异常甲基化的重要因素，目前所知的DNMTs可分为DNMT1和DNMT3两种，其中，DNMT1与甲基化的形成有关，DNMT3则参与甲基化状态的维持（Okano et al.，1999;Ooi et al.，2007）。关于miR-148b的研究，发现其与多种癌症相关，如血液恶性肿瘤（王晓雪等，2015）、肝癌（谭翠和莫春容，2016）、乳腺癌（Chen et al.，2018）、胃癌（Li et al.，2018）和腎癌（Zhang et al.，2018）等。王晓雪等（2017）研究表明，miR-148b在急性髓系白血病患者及细胞系中的表达水平较正常对照显著降低，主要发挥抑癌基因表达的作用。此外，谭翠和莫春容（2016）研究显示miR-148b通过靶向调控双特异性磷酸酶1（DUSP1）影响细胞因子CD206的分泌，进而参与肝癌的发生发展过程。【本研究切入点】目前，国内外研究均表明miR-148/152家族在一些生物的肿瘤性疾病中发挥着抑癌基因作用，或在生物的器官发育过程中起调节作用，但至今鲜见以广西巴马小型猪为动物模型研究miR-148b抑制肿瘤发生发展作用机理的相关报道。【拟解决的关键问题】以广西巴马小型猪为研究对象，构建pLV-miR-148b慢病毒表达载体，验证miR-148b在293T细胞中的表达情况，并对其靶基因进行预测及相关通路分析，为揭示miR-148b的作用机制打下基础。