摘 要：利用新孢子虫感染小鼠血清对新孢子虫cDNA表达文库进行SEREX筛选，获得的阳性克隆经测序后进行Blast分析，并利用生物学软件对其编码的蛋白结构进行预测。结果显示，经筛选共获得了4个阳性克隆序列，分别为新孢子虫表面抗原SAG1，两个假定蛋白（XM_003882171.1）和（XM_003882600.1），以及一个未命名蛋白（XM_003885351.1）。研究共获得了4个新孢子虫免疫相关蛋白，为新孢子虫诊断及其疫苗研究等研究奠定了基础。
关键词：犬新孢子虫；cDNA表达文库；免疫相关蛋白；筛选
中图分类号：R382.9 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.10.001
Screening on Immune Associated Protein of Neospora caninum and Its Analysis of Biological Information
YANG Sheng1，2， GONG Pengtao1， LI Jianhua1， LYU Qiang1，YANG Ju1 ， LI He1， ZHANG Xichen1
（1.College of Veterinary Medicine，Jilin University， Changchun， Jilin 130062， China； 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）
Abstract：By SEREX， the cDNA expression library of Neospora caninum were screened using mice serum infected with Neospora caninum. The positive clones were sequenced and analyzed by the biology software. The results showed that four positive clones sequence were obtained which were one surface antigen SAG1 of N.caninum， two putative protein （XM_003882171.1） and （XM_003882600.1）， and an unnamed protein（XM_003885351.1） respectively. Four immune associated proteins were successfully obtained， which lay the foundation for the diagnosis and vaccine of Neospora caninum.
Key words： Neospora caninum；cDNA expression library；immune associated protein；screening
犬新孢子蟲（Neospora caninum）是一种新发现的胞内寄生性原虫，最早由Bjerkas于1984年在患脑膜炎和肌炎的幼犬体中发现，并由Dubey于1988年根据其形态特征命名为犬新孢子虫。目前，新孢子虫呈世界性分布，在中国刘群等于2007年在流产胎牛脑组织中发现了新孢子虫，证实了我国也存在新孢子虫的感染[1]。新孢子虫可感染犬、牛等多种动物，寄生于宿主体内可导致孕畜流产或产死胎以及新生幼畜运动神经障碍和神经系统疾病，给养殖业带来巨大损失。
新孢子虫对宿主细胞的粘附/侵入是其发病机制中一个重要的过程。首先，微线蛋白介导新孢子虫胞外膜紧密附着在其宿主细胞细胞膜上[2]，与细胞膜上受体结合并形成可移动的连接区域[3]。经棒状体蛋白对宿主细胞进行修饰后[4-5]，宿主细胞膜内陷并形成纳虫泡，并在细胞骨架驱动下向速殖子末端靠拢，直至其完全进入空泡中。之后致密颗粒蛋白修饰纳虫空泡，该修饰过程在空泡内骨架结构的形成中起重要作用，并且不易被溶酶体所裂解。在纳虫空泡内，新孢子虫约2～3 d即可繁殖5～6代，待在宿主细胞裂解后，速殖子可侵入新的宿主细胞并完成下一轮的侵入过程[5-6]。然而，新孢子虫的粘附/侵入过程是一个复杂的过程，仍需要进一步研究。新孢子虫免疫相关蛋白属于粘附/侵入相关的蛋白，在新孢子虫感染宿主过程中起重要作用，由其制备的疫苗可抑制新孢子虫对宿主细胞的侵入，并对新孢子虫病起保护效果。
cDNA表达文库是获得免疫相关蛋白简单有效的工具。目前，关于新孢子虫表达文库的研究较多，张侯双等[7]利用抗弓形虫血清从新孢子虫速殖子cDNA表达文库中筛选出一交叉抗原AMA1，利用其制备的多抗可抑制新孢子虫和弓形虫对宿主细胞的侵入。并且，他还获得了核糖体磷蛋白PO，它可作为新孢子虫和弓形虫的候选疫苗抗原[8]。Atkinson等[9]利用抗新孢子虫血清从cDNA表达文库中筛选获得了GRA1和NcP20，免疫小鼠后可刺激机体产生IgG抗体。此外，从表达文库中获得的新孢子虫免疫相关蛋白还有NcMIC3[10]，GRA2[11]，二硫键异构酶蛋白（PDI），热应激蛋白70（HSP70）和核糖体蛋白（RP1）[12]以及GRA7[13]，这些蛋白抗原的获得为新孢子虫的免疫保护机制和新孢子虫诊断及疫苗的研究提供了原材料。
本研究利用鼠抗犬新孢子虫的免疫血清对新孢子虫速殖子文库进行了SEREX法筛选，以期获得新孢子虫免疫相关抗原蛋白基因，为新孢子虫病诊断和疫苗的研究奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 主要试剂 新孢子虫速殖子cDNA表达文库为笔者所在实验室所构建， E.coli XL-blue大肠杆菌购自Clontech公司，2×PCR 预混料购自天跟公司，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德生物公司，硝酸纤维素膜（NC 膜）购自Pall公司，IPTG购自Promege公司。
1.1.2 引物合成 用于筛选文库的引物由上海生工合成，序列为：上游引物，5"-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3"；下游引物，5"-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3"。
1.2 方 法
1.2.1 抗新孢子虫血清的准备 将新孢子虫（2×105）接种BALB/c小鼠，50 d后收集免疫血清；将大肠杆菌XL1-Blue扩大培养并收集XL1-Blue菌，反复冻融数次后超声破碎，收集上清液（12 000 g，20 min），将上清液用封闭液稀释（1∶10）后与小鼠免疫血清（2∶1）混合，室温下共同温育4 h以去除交叉反应性抗体，所得孵育血清即为所需的一抗血清。
1.2.2 新孢子虫速殖子cDNA表达文库的筛选 文库的筛选参考候洪烈筛选方法[14]，步骤如下。首先，在平皿中铺噬菌体文库，放于37 ℃培养箱中培养λ噬菌体至噬菌斑长至针尖大小；然后将硝酸纤维素膜编号后浸泡在10 mmol·L-1的IPTG中10 min，取出并用滤纸吸去水珠后覆盖在平皿中的噬菌斑表面并做好标记，滤膜一旦与平板接触后，切勿再移动。37 ℃培养箱中继续培养6～8 h，小心用平头镊子剥离滤膜。将剥离滤膜后的平板保存在4 ℃冰箱中备用。
将硝酸纤维素膜用10%胎牛血清封闭2 h；清洗后用制备的一抗（1∶500稀释）4 ℃孵育过夜；清洗后用羊抗鼠IgG二抗孵育（1∶2 000）2 h，清洗后DAB显色；挑取与硝酸纤维素膜显色相对应的平皿上阳性噬菌斑进行复筛以去除假阳性的噬菌体，之后挑去阳性噬菌斑于噬菌体缓冲液中，4 ℃过夜备用。
1.2.3 基因的序列测定与分析 （1）PCR鉴定。取50 μL挑取的噬菌斑缓冲液，100 ℃煮10 min，12 000 g离心10 min，取上清（即噬菌体基因组模板）。利用PCR预混料进行PCR扩增，体系为PCR Mix 25 μL、上游引物 1 μL、下游引物1 μL、基因组模板1 μL、ddH2O 22 μL，程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min，取PCR产物6 μL进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送上海生工测序。（2）序列分析。将测序后得到的序列登陆NCBI BLAST进行核酸同源性比较并利用ExPASy（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）和InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）进行氨基酸序列分析。
2 结果与分析
2.1 免疫筛选
利用免疫血清对新孢子虫速殖子cDNA表达文库进行筛选后，共得到4个阳性克隆序列，分别命名为NC-A、NC-B、NC-C和NC-D，图1为免疫血清对文库复筛结果。
2.2 Blast比对及蛋白结构预测
NC-A测序后经Blast分析，其核酸序列分别与新孢子虫表面抗原SAG1（gb|AF141960.1|）同源性为100%，ExPASy（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）和InterProscan （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）生物学软件分析结果表明，SAG1序列全长820 bp，编码273个氨基酸aa，蛋白分子量为29 kDa，等电点为6.74，含有8个表面抗原结构域和2个SAG结构域（图2），因此，属于表面抗原类蛋白。
NC-B核酸序列经比对与假定蛋白（XM_003882171.1）同源性为99%，ExPASy和InterProscan 生物学软件分析结果表明，该蛋白（XM_003882171.1）序列全长1 563 bp，编码462个氨基酸，蛋白分子量为52 kDa，等电点为8.87，含有一个多聚（ADP-Ribose）水解酶结构域和一个PARG-cat结构域（图3），推测其属于水解酶类蛋白。
NC-C核酸序列经比对与假定蛋白（XM_003882600.1）同源性为100%，ExPASy和InterProscan 生物学软件分析结果表明，该假定蛋白序列全长750 bp，编码249个氨基酸，蛋白分子量为29 kDa，等电点为10.30，含有DUF1777结构域和一个PTHR31077结构域（图4），其功能未知。
NC-D核算序列经比对与新孢子虫未命名蛋白（XM_003885351.1）同源性为100%，并且与弓形虫棒状体蛋白（XM_002364659.1）同源性为85%，ExPASy和InterProscan 生物学软件分析结果表明，该未命名蛋白（XM_003885351.1）序列全长2 838 bp，编码945个氨基酸，蛋白分子量为108 kDa，等电点为8.14，含有一个lipase结构域1個PTHR14463结构域（图5），推测其属于棒状体类蛋白。这些免疫相关蛋白的获得为新孢子虫免疫保护机制和新孢子虫疫苗抗原的研究奠定了基础。
3 结论与讨论
新孢子虫病分布范围广，危害严重，然而目前并没有有效的疫苗可以预防新孢子虫病。保护性抗原是研究寄生虫疫苗的一种重要原材料，但由于目前对新孢子虫侵入机体的机制不是很了解，所获得的新孢子虫保护性抗原相对较少。对于新孢子虫抗原，目前研究较多的有表面抗原 NcSAG1 和NcSRS2[15]，致密颗粒抗原 NcGRA2， NcGRA6[16]，NcGRA7[17] 以及NcMAG1[18] ， 微线蛋白NcMIC1 和 NcMIC3 [19-20] ， 棒状体蛋白NcROP2 [21]，顶膜抗原 NcAMA1[22]、亲环蛋白 [23] 、核糖体蛋白 NcP0 [24] 和热应激蛋白NcsHSP33 [17] ，这些抗原对于新孢子虫诊断及疫苗的研究起到了重要作用，然而仍缺乏理想的诊断抗原和有效的新孢子虫疫苗抗原。
cDNA 文庫免疫学筛选是目前获得免疫相关抗原简单有效的方法。该方法已广泛应用在柔嫩艾美尔球虫[25]、毒害艾美耳球虫[26]、旋毛虫[27]、日本血吸虫[28]和华支睾吸虫[29]等寄生虫相关抗原的研究中。SEREX技术是Sahin等建立的cDNA 表达文库血清学筛选方法，通过抗原抗体特异性结合原理获得抗原，已被广泛用于各种寄生虫抗原的鉴定。本研究利用SEREX技术对新孢子虫cDNA 表达文库进行免疫学筛选，同时采取了将血清与大肠杆菌裂解液共同孵育的方法，从而有效地避免出现假阳性的出现[14]。通过对新孢子虫cDNA文库的筛选，获得了新孢子虫新孢子虫表面抗原SAG1，两个假定蛋白（XM_003882171.1）和（XM_003882600.1），以及一个未命名蛋白（XM_003885351.1），同源性为100%（该序列同时与弓形虫棒状体蛋白（XM_002364659.1）同源性为85%）。这些免疫相关蛋白为今后新孢子虫诊断及其疫苗研究等研究奠定了基础。
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