摘 要：细胞内自噬水平监测方法的建立是深入揭示自噬调控机制和生理功能的重要基础。ATG8蛋白定位于自噬小体膜上，对其荧光蛋白标记分子的荧光观察是监测细胞内自噬发生水平的重要方法。本研究选择小麦ATG8家族的TaATG8h基因，构建了GFP-TaATG8h和DsRED-TaATG8h融合基因表达载体，载体构建的正确性得到酶切和测序结果的确认；以易于转化的小麦原生质体为受体，实现了两个融合基因在原生质体细胞中的高效表达，在表达融合蛋白的细胞中观察到了清晰的荧光。本研究结果为在重要农作物小麦上建立以ATG8为靶标的自噬水平监测技术和深入探索自噬在小麦生长发育中的作用奠定了基础。
关键词：小麦；细胞自噬；ATG8；原生质体
中图分类号：S512.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.004
Abstract： The establishment of autophagy monitoring method was important for revealing the regulation mechanisms and physiological functions of autophagy. ATG8 locates on autophagosome membranes and its fluorescent protein-tagged forms have been successfully used to monitor autophagy level in cells. In this study， TaATG8h， one member of the wheat ATG8 family， was selected and GFP-TaATG8h and DsRED-TaATG8h fusion gene expression vectors were constructed. The correctness of constructed vectors was confirmed by results of restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Wheat protoplasts， which were easily transformed with genes， were used to express the two fusion genes， and clear fluorescence was observed in the cells expressing fusion proteins. The results of this study laid a foundation for establishing ATG8-based autophagy monitoring technology and for exploring the role of autophagy in the important crop species of wheat.
Key words：wheat； autophagy； ATG8； protoplast
細胞自噬（autophagy）是真核生物细胞内一种保守的物质分解和循环利用机制。在自噬过程中，细胞质内待降解底物被包裹进双层膜结构的自噬小体，随着自噬小体外膜与液泡（动物是溶酶体）膜的融合，内膜及包裹的底物（此时称为自噬小泡）进入液泡腔被分解[1-3]。多种自噬相关因子（autophagy-related factor，ATG）参与到自噬小体组装、底物选择、自噬小体与液泡的融合及这其中的信号调控等过程。ATG8是自噬核心机制中研究得最清楚的ATG因子，其通过一个类泛素化过程与脂类分子磷脂酰乙醇胺（PE）连接形成ATG8-PE定位于自噬小体内、外膜表面，藉此征集其他ATG因子推动自噬小体膜的起始、延伸、合拢及与液泡的融合等过程[4-6]。细胞内自噬水平的监测是开展自噬分子机制和生理功能研究的必要手段。鉴于ATG8对自噬小体膜的标志性装饰，其被荧光蛋白标记后在细胞内的点状荧光可作为观察指标来表征细胞内的自噬小体积累情况，从而反应细胞内自噬的发生水平[7]。目前此类方法已经在酵母、动物和模式植物拟南芥、水稻上得到应用[8-9]，但在重要农作物小麦上还未见报道。
酵母只有一个ATG8，而高等生物ATG8则是由多个成员构成的基因家族。此前，我们在小麦上鉴定了9个ATG8（TaATG8a-8h）基因，证实他们参与了小麦的细胞自噬过程[10]。在此基础上，本研究构建了小麦TaATG8h的GFP和DsRED融合基因表达载体，并实现了融合基因在小麦叶肉细胞原生质体中的高效表达，旨在为在小麦上建立以ATG8为靶标的自噬水平监测技术和深入探索自噬在小麦生长发育中的作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 表达载体的构建
小麦TaATG8h由本实验室克隆，其全长 cDNA保存于 pLB-ATG8h载体上。以载体pA7-GFP为基础构建融合基因表达载体，该载体上含有XbaⅠ和SacⅠ位点用于插入目标基因并与GFP融合。设计合成用于扩增TaATG8h完整ORF的引物对8h-F（GCTCTAGAAATGA AGTCCTTCAAGAAGGA）/8h-R（CGAGCTCTCACCCAAATGTCTTCTCGC）。使用该引物对和pfu DNA聚合酶，以pLB-ATG8h质粒为模板进行PCR扩增。扩增产物和pA7-GFP质粒经XbaⅠ/SacⅠ双酶切后进行连接。使用酶切和测序方法鉴定重组克隆，随后将构建的GFP-TaATG8h融合基因表达载体命名为pGFP-A8h。DsRED-TaATG8h融合基因表达载体pRED-A8h的构建是以pGFP-A8h为基础，将该载体上的GFP基因替换为DsRED基因。其过程为：使用引物对DsRed-F（CCGCTCGAGATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATCA） /DsRed-R（GCTCTAGAGCCAGGAACAGGTGGTGGCGGC）从pHBT-DsRed-NOS载体上扩增不含终止密码子的DsRED基因ORF序列，扩增产物经XhoⅠ/XbaⅠ双酶切后替换pGFP-A8h载体上的GFP基因ORF。构建的pRED-A8h载体经酶切和测序进行确认。使用去内毒素质粒提取试剂盒EndoFree Plasmid Maxi Kit （Qiagen）提取pGFP-A8h和pRed-A8h载体质粒，浓度调至1 μg·μL-1，用于后续的原生质体转化。
1.2 小麦叶肉细胞原生质体的制备和基因转化
选取健康饱满的苏麦3号种子置于培养皿中萌发。将出芽后的种子移至营养土，并置于人工气候箱中，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗条件下生长，待幼苗长至5 cm左右时改为24 h黑暗条件诱导黄化苗。当黄化苗第二片真叶长至10 cm左右时，取第二片真叶参照杜晓敏等[11]方法进行叶肉细胞原生质体的制备和PEG-Ca2+介导的质粒转化。将转化后的原生质悬浮至1 mL的WI溶液（0.7 mol·L-1甘露醇，4 mmol·L-1 MES，20 mmol·L-1 KCl）中，于室温、黑暗条件下静置保存。
1.3 荧光观察
转化后24 h，吸取原生质细胞置于血球计数板上，在正置荧光显微镜（DM5000，Leica）下观察细胞内GFP或DsRED荧光。
2 结果与分析
2.1 GFP/DsRED-TaATG8h融合基因表达载体的构建
成熟ATG8的C末端必须是甘氨酸残基，并通过该残基与PE连接后定位至自噬膜上。对于刚翻译完成的ATG8，其C端甘氨酸外侧的多余残基会由ATG4加工切除。因此，构建ATG8的融合基因表达载体时，一般将ATG8序列融合于熒光蛋白基因的下游。使用常规的酶切、连接和大肠杆菌转化方法构建GFP-TaATG8h融合基因的表达载体pGFP-A8h。
候选重组质粒经插入位点两侧的XbaⅠ/SacⅠ双酶切能够正确切出368 bp 的TaATG8h基因片段（图1A），结合DNA测序结果，表明GFP-TaATG8h融合基因表达载体（pGFP-A8h）构建正确；图1A上方显示了该载体上GFP-TaATG8h融合基因表达盒的结构，融合基因的表达由两个串联的35S启动子驱动。
DsRED-TaATG8h融合基因表达载体pRED-A8h的构建是以构建好的pGFP-A8h为基础，使用XhoⅠ/XbaⅠ切点将载体上的GFP基因替换为DsRED基因。候选重组质粒经XhoⅠ/XbaⅠ双酶切能够正确切出694 bp的DsRED基因片段（图1B），结合DNA测序结果，表明pRED-A8h载体的构建正确；图1B上方显示了该载体上DsRED-TaATG8h融合基因表达盒的结构，融合基因的表达同样由两个串联的35S启动子驱动。
2.2 GFP/DsRED-TaATG8h融合基因的小麦原生质体转化和表达
使用PEG-Ca2+介导的转化方法将构建的两个融合基因表达载体质粒分别转化到小麦叶肉细胞原生质体中。转化后24 h的荧光观察结果显示，两个融合基因GFP-TaATG8h和DsRed-TaATG8h均能够在原生质体中正确表达，GFP-TaATG8h融合蛋白在细胞中发出绿色的荧光（图2A），DsRed-TaATG8h融合蛋白在细胞中发出红色的荧光（图2B）；两个融合基因的转化效率均超过50%。
3 结论与讨论
自噬与植物的生长、发育、衰老和逆境响应等过程密切相关[12-14]。细胞内自噬水平监测方法的建立是深入揭示自噬调控机制和生理功能的重要基础。ATG8蛋白定位于自噬小体膜上，因而是自噬小体的重要标志分子。应用上通常使用转化方法在细胞内表达荧光蛋白标记的ATG8，进而通过对细胞内点状荧光的观察和统计来反映自噬小体的积累和自噬发生的程度[7]。植物上，此类自噬监测方法已经在拟南芥和水稻等模式物种上得到应用[8-9]，但在重要农作物小麦上还未见报道，限制了对小麦自噬功能的深入研究。建立靶向ATG8的自噬监测方法的前提是构建荧光蛋白基因-ATG8融合基因表达载体，并通过转化实现融合蛋白在细胞内的高效表达和荧光激发。本研究选择小麦ATG8家族的TaATG8h基因，构建了该基因融合于GFP/DsRED下游的融合基因表达载体，载体构建的正确性得到酶切和测序结果的确认；以易于进行基因转化的小麦叶肉细胞原生质体为受体，通过转化实现了两个融合基因在原生质体细胞中的高效表达，在表达融合蛋白的细胞中观察到了清晰的荧光。本研究结果为在小麦上建立以ATG8为靶标的自噬水平监测技术和深入探索自噬在小麦生长发育中的作用奠定了基础。
参考文献：
[1]LIU Y， BASSHAM D C. Autophagy： pathways for self-eating in plant cells [J]. Annu rev plant biol， 2012， 63： 215-237.
[2]LI F， VIERSTRA R D. Autophagy： a multifaceted intracellular system for bulk and selective recycling[J]. Trends plant sci， 2012， 17： 526-537.
[3]YOSHIMOTO K. Beginning to understand autophagy， an intracellular self-degradation system in plants[J]. Plant cell physiol， 2012， 53： 1355-1365.
[4]NAKATOGAWA H， ICHIMURA Y， OHSUMI Y. Atg8， a ubiquitin-like protein required for autophago- some formation， mediates membrane tethering and hemifusion[J]. Cell， 2007， 130： 165-178.
[5]XiE Z， NAIR U， KLIONSKY D J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation[J]. Mol biol cell， 2008， 19： 3290-3298.
[6]NAIR U， YEN W L， MARI M， et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis[J]. Autophagy， 2012， 8： 780-793.
[7]KLIONSKY D J， ABDELMOHSEN K， ABE A， et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy （3rd edition） [J]. Autophagy， 2016， 12： 1-222.
[8]CONTENTO A L， XIONG Y， BASSHAM D C. Visualization of autophagy in Arabidopsis using the fluorescent dye monodansylcadaverine and a GFP-AtATG8e fusion protein[J]. Plant J， 2005， 42： 598-608.
[9]IZUMI M， HIDEMA J， WADA S， et al. Establishment of monitoring methods for autophagy in rice reveals autophagic recycling of chloroplasts and root plastids during energy limitation[J]. Plant physiol， 2015， 167： 1307-1320.
[10]PEI D， ZHANG W， SUN H， et al. Identification of autophagy-related genes ATG4 and ATG8 from wheat （Triticum aestivum L.） and profiling of their expression patterns responding to biotic and abiotic stresses[J]. Plant cell rep， 2014， 33： 1697-1710.
[11]杜曉敏， 王均， 安子玄， 等. 小麦叶肉细胞原生质体制备参数解析及在基因瞬时表达上的应用[J]. 华北农学报， 2015， 30（6）： 52-60.
[12]BASSHAM D C， LAPORTE M， MARTY F， et al. Autophagy in development and stress responses of plants[J]. Autophagy， 2006， 2： 2-11.
[13]HAYWARD A P， DINESH-KUMAR S P. What can plant autophagy do for an innate immune response[J]. Annu rev phytopathol， 2011， 49： 557-576.