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摘要：目的 观察大黄素对人肝癌HepG2细胞迁移侵袭能力及E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Slug蛋白表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 体外培养HepG2细胞，大黄素低、高剂量组分别加入10、20 μmol/L大黄素，阴性对照组加入等体积RPMI-1640培养液，阳性对照组加入10 μmol/L 5-氟尿嘧啶。分别采用细胞-基质黏附实验、划痕修复实验、Transwell小室体外侵袭实验观察HepG2细胞黏附率、迁移、侵袭能力；Western blot检测E-cadherin和Slug蛋白表达。结果 与阴性对照组比较，大黄素低、高剂量组显著抑制HepG2细胞黏附率、迁移、侵袭能力，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，Slug蛋白表达水平显著降低（P<0.05，P<0.01），并呈浓度依赖性。结论 大黄素能明显抑制HepG2细胞迁移和侵袭能力，其机制可能与增强E-cadherin及抑制Slug蛋白表达有关。 关键词：大黄素；肝细胞癌；迁移；侵袭；E-钙黏蛋白；Slug蛋白
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0064-04
Abstract： Objective To investigate the effects of emodin on the migration and invasion ability and expressions of E-cadherin and Slug of human hepatoma cell lines HepG2； To discuss the possible mechanisms of anti-hepatocellular carcinoma. Methods HepG2 cells were cultured in vitro. The experimental group was treated with emodin at concentrations of 10 μmol/L and 20 μmol/L as. The negative control group was treated with the same volume of RPMI-1640 medium， while the positive control group was treated with 10 μmol/L floxuridine. The cell matrix adhesion assay， wound healing and transwell chamber in vitro invasion assay were used to observe the effects of emodin on HepG2 cell adhesion rate and migration and invasion ability. Western blot analysis was used to observe the changes of expressions of E-cadherin and Slug. Results Compared with the negative control group， emodin inhibited significantly HepG2 cell adhesion rate and migration and invasion ability were in a dose-dependent manner （P<0.05， P<0.01）； Western blot analysis showed that the protein expression of E-cadherin increased significantly， and the level of Slug decreased significantly in a dose-dependent manner （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Emodin can significantly inhibit migration and invasion of HepG2 cells， which mechanism may up-regulate expressions of E-cadherin and down-regulate Slug.
Key words： emodin； hepatocellular carcinoma； migration； invasion； E-cadherin； Slug protein
大黄素是从大黄中提取的有效单体，具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等功效功效[1-2]。近年研究发现，大黄素抗肿瘤作用明显，对宫颈癌、大肠癌、肝癌细胞等肿瘤细胞具有杀伤和抑制作用[3-5]，大黄素还可通过促进人肝癌HepG2细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用[6]。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国目前十分常见的消化道恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、早期症状不典型、恶性程度高、临床治疗困难、预后不良、病死率高等特点，迁移和侵袭是患者死亡和治疗效果不理想的主要原因[7]。目前放疗、化疗等治疗HCC的手段已经进入平台期，然而其分子机制尚未明了。虽然大黄素具有促进HepG2细胞凋亡作用，但是有关其对HepG2细胞迁移和侵袭的影响国内鲜见报道。另外，E-钙黏蛋白（E-cadherin）和Slug蛋白被证实是与多种恶性肿瘤迁移和侵袭相关的蛋白。因此，本研究采用体外培养HepG2细胞，观察大黄素对HepG2细胞迁移侵袭能力及E-cadherin、Slug蛋白表达的影响，探讨其相关作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞
人肝癌HepG2细胞，哈尔滨医科大学第三附属医院消化内科惠赠。
1.2 药物及制备
大黄素购自中国食品药品检定研究院，批号140675-201410。1 mg大黄素溶于200 μL 0.1%二甲基亚砜（DMSO）溶液，溶解后依次加入7.4 mL灭菌三蒸水、50 μL 5 mol/L NaOH溶液，过滤后溶液作为母液，浓度为500 μmol/L，-20 ℃冰箱保存备用，临用时以灭菌三蒸水稀释至所需浓度。
1.3 主要试剂及仪器
5-氟尿嘧啶（5-Fu），上海海普药厂，批号150073； DMSO，徐州试剂二厂，批号150217；牛血清白蛋白（BSA），PAA公司，批号715396；Matrigel基质胶和RPMI-1640培养液，美国HyClone公司；E-cadherin、Slug多克隆抗体，美国ProMab公司；辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG二抗，美国Santa Cruz公司；Trizol试剂盒，美国Invitrogen公司。CO2培养箱（MCO-20AIC），日本SANYO；紫外可见分光光度计（Libra S22），英国Biochrom；移液枪（Thermo F2），美国Thermo；倒置显微镜（CKX41），日本Olympus；荧光显微镜（IX51），日本Olympus。
1.4 细胞培养
HepG2细胞培养于含有10%BSA和5%青-链霉素双抗的RPMI-1640培养液中。置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。2～3 d更换培养液，当HepG2细胞达80%汇合度时，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养48 h。收集悬浮细胞经EDTA处理制备成单细胞悬液，然后用RPMI-1640培养液洗涤细胞。收集对数生长期细胞，用于后续实验。
2 实验方法
2.1 细胞-基质黏附实验
参照文献[8]及预实验结果，低剂量组加10 μmol/L大黄素50 μL，高剂量组加20 μmol/L大黄素50 μL，阳性对照组加10 μmol/L 5-Fu 50 μL，阴性对照组加50 μL RPMI-1640培养液，37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养24 h。调整细胞密度1×105个细胞/mL，接种于涂有10 μg/mL Ⅳ型胶原500 μL的24孔板中，37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养30 min。PBS洗涤去除未结合的悬液细胞，乙醇固定贴壁细胞。0.1%结晶紫染色，0.2%Triton X-100固定，于波长550 nm处紫外分光光度法测定吸光度（A）值，计算细胞黏附率。细胞黏附率（%）=实验组细胞A值÷阴性对照组细胞A值×100%
2.2 划痕修复实验
HepG2细胞按照细胞密度1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞单层生长铺满板底时，用移液枪头沿培养板底部划“一”字型划痕。各组给药同“2.1”项。37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养24 h。镜下检测细胞向致伤区迁移的相对距离并拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率（%）=实验组细胞迁移面积÷阴性对照组细胞迁移面积×100%。实验重复3次，取其平均值。
2.3 Transwell小室体外侵袭实验
Transwell小室用前铺上50 µL 0.5%Matrigel膜基质37 ℃孵育过夜。HepG2细胞各组给药同“2.1”项。调整细胞密度1×105个/mL，分别取200 µL接种于Transwell小室内室，并在Transwell小室下室加入含有10%BSA的RPMI-1640培养液。孵育24 h后，取出Transwell小室，去除未穿膜细胞。甲醇固定15 min。OlympusIX51荧光显微镜计数穿过微孔膜的细胞数。每组细胞随机选取10个视野计数，取其平均值。实验重复3次。
2.4 Western blot检测E-钙黏蛋白和Slug蛋白表达
HepG2细胞各组给药同“2.1”项。37 ℃、5%CO2及饱和湿度培养24 h。按细胞总蛋白抽提试剂盒说明书提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白质含量。取50 µg蛋白质进行10%～12%SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后，湿法电转印至PVDF膜，用含1%脱脂奶粉TBS和0.1%TBST封闭超过2 h，TBST洗膜3次，每次3 min，加E-cadherin或Slug多克隆抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次3 min。加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000），常温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次3 min。β-actin作为内参照。ECL化学发光试剂显色，通过富士生物图像处理软件进行目的条带的表达检测及分析。
3 统计学方法
采用Graphpad5.0软件进行描述性统计。实验数据以—x±s表示，正态分布资料组间比较采用t检验，多样本均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 大黄素对HepG2细胞黏附能力的影响
与阴性对照组比较，大黄素低、高剂量组对HepG2细胞黏附率具有明显抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），并呈浓度依赖性，见图1。
4.2 大黄素对HepG2细胞迁移能力的影响
与阴性对照组比较，大黄素低、高剂量组对HepG2细胞迁移具有明显抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），并呈浓度依赖性，见图2。
4.3 大黄素对HepG2细胞体外侵袭能力的影响
与阴性对照组比较，大黄素低、高剂量组对HepG2细胞侵袭能力具有明显抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），并呈浓度依赖性，见图3。
4.4 大黄素对HepG2细胞E-钙黏蛋白、Slug蛋白表达的影响
与阴性对照组比较，大黄素低、高剂量组HepG2细胞E-cadherin蛋白表达明显升高（P<0.01），Slug蛋白表达明显降低（P<0.01），并呈浓度依赖性，见图4。
5 讨论
HCC高死亡率的主要因素之一是迁移和侵袭特别迅速，而上皮-间质转变（epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT）是增强癌细胞的原位侵袭和远处迁移以及抑制癌细胞凋亡的一个关键因素。
EMT最主要的标志性变化是E-cadherin表达的减少或丢失。E-cadherin是一类主要介导细胞之间相互黏附的钙依赖性跨膜蛋白，主要表达在上皮细胞，广泛参与细胞间的连接，对于维持正常上皮细胞的完整性十分重要。研究表明，E-cadherin结构和功能异常可致癌细胞间黏附松散，癌细胞极易从原发部位脱落，并沿淋巴管血管外膜及组织间隙浸润蔓延，破坏邻近正常组织并继续生长，形成转移癌[9]。E-cadherin的表达下调或抑制和功能丧失均可启动EMT，癌细胞经过这种细胞表型的转化获得更高的侵袭性。在对E-cadherin表达调控的研究中发现，Slug起到决定性作用。Slug是Snail超家族成员之一，能识别E-cadherin基因启动子上E2-box元件以抑制靶基因E-cadherin的转录，下调E-cadherin蛋白表达，共同促进癌细胞的原位侵袭和远处转移。有研究表明，Slug的过表达同时伴有E-cadherin的低表达或缺失与诱发胰腺癌、骨肉瘤、结直肠癌、口腔鳞癌等肿瘤的发生、发展和转移高度相关[10-13]。
本研究发现，大黄素可显著抑制HepG2细胞基质黏附能力，提示大黄素可能具有潜在抑制HepG2细胞迁移和侵袭的能力。划痕修复实验和Transwell小室体外侵袭实验结果显示，大黄素可显著降低HepG2细胞迁移率和侵袭细胞数，提示大黄素可抑制HepG2细胞迁移和侵袭能力。为了进一步验证大黄素抑制HepG2细胞迁移和侵袭的机制，本研究对E-cadherin和Slug的表达进行了分析。Western blot分析结果显示，大黄素可显著增强E-cadherin蛋白表达并且抑制Slug蛋白表达，提示大黄素抑制HepG2细胞迁移和侵袭能力可能是通过增强E-cadherin的蛋白表达以及抑制Slug的蛋白表达而实现的。
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（收稿日期：2015-08-17）
（修回日期：2015-09-03；编辑：华强）