评价，以期为云芝免疫调节蛋白的后续研究提供有价值的参考。
关键词：云芝；免疫调节蛋白；提取；免疫活性
中图分类号：Q914.83 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150932002
药用真菌云芝在民间医学中的应用研究由来已久，以往的研究主要是针对云芝多糖，从蛋白质角度研究云芝的活性鲜有报道[1，2]。既往针对其他药用真菌免疫调节蛋白的研究表明，利用传统技术从天然菌丝体中提取免疫调节蛋白不但费时费力且产率极低，而利用基因工程技术获得的真菌免疫调节蛋白初步证据表明不但产率高且它们具有体外抗肿瘤活性，在免疫增强作用和保护肝脏的作用已普遍用于临床[3，4]。
为了更好的开发药用真菌中的活性物质，提高药用真菌种质资源的利用率，本文以FIP-Cve为研究材料，从巴斯德毕赤酵母pPIC9-fip-cve-m表达系统中诱导表达该蛋白，并通过一系列纯化鉴定后检测其生物特性及生理活性。
1 实验材料
毕赤酵母表达载体pPIC9-fip-cve-m为本实验室保存；MTT试剂盒购自于Sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 重组蛋白的大量诱导表达及鉴定：
取Fip-cve-m酵母菌体密度为0.5OD的菌液，转接到含有甲醇的诱导培养基BMMY（pH值7.5）中诱导表达4d。每隔24h加一次甲醇至终浓度为0.8%，离心收集上清。通过离子交换层析方法纯化后冻干浓缩。SDS-PAGE检测。
2.2 MTT法检测FIP-Cve对小鼠HeLa细胞增殖的抑制作用
将处于对数生长期的hela细胞（宫颈癌细胞）用0.25%胰蛋白酶进行消化，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液终止消化，制成细胞悬液，并计数。将细胞密度调整为3.0×104个/ml，接种于96孔板中，每孔100µl，在37℃湿度饱和的 5% CO2孵箱下培养24h。将96孔板中的培养液吸去，向96孔板中分别加入已配置不同浓度的免疫调节蛋白溶液，每孔100µl，每个浓度做3个复孔，将其于37℃湿度饱和的5%CO2孵箱下培养48h，再加入20µlMTT溶液，于37℃湿度饱和的 5% CO2孵箱下培养4h，小心吸去上清，然后加入150µlDMSO，室温下避光震荡10min，在495nm下测定吸光度值，观察不同浓度FIP-Cve对hela细胞增殖的抑制作用。
3. 结果与分析
酵母转化子菌液经超声破碎，离心取上清经Ni亲和层析柱纯化后，进行10% SDS-PAGE电泳分析，在约13kDa处出现清晰的目的蛋白条带，结果显示与预期大小相符，且蛋白纯度高、杂质少，测定蛋白总浓度为115.34mg/ml。
由图2可知，细胞培养48h后。MTT法证实Fip-cve蛋白对Hela细胞的分裂和增值具有明显的抑制作用。并呈明显的浓度依赖。随之免疫调节蛋白浓度的增加，抑制率也隨之上升。当蛋白浓度到200μg/mL，抑制率最高达17.3%。通过实验也证明Fip-cve蛋白对小鼠脾淋巴细胞的催分裂效果。具体的条件和实验结果还在进一步的优化当中。
4 结论
近年来，毕赤酵母作为重组蛋白的生产宿主已经获得了广泛的应用。已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。与大肠杆菌等原核宿主相比，毕赤酵母具有很多优点，如表达效率高，表达的蛋白活性较高，不会出现包涵体现象[5]。本研究对毕赤酵母表达的Fip-cve重组蛋白进行了提取鉴定及生物活性分析，这些工作为研究毕赤酵母表达外源基因奠定了技术基础。同时也为工业表达云芝Fip-cve重组蛋白，以及为开发Fip-cve重组蛋白药物奠定了物质和技术基础。
参考文献
[1] Xu X， Yan H， Chen J et al. Bioactive proteins from mushroom[ J] .Biotechnol Adv， 2011，29（6）：667-674.
[2] Kino K， Yamashita A， Yama.K et al. Isolation and Characterization of a New Immuno- modulatory Protein， Ling Zhi-8 （LZ-8） from Ganoderrna lucidiurn[ J]. Boil. Chem，1989（1）：472-478.
[3] Lin W H， Hung C H， Hsu C I et al. Dimerization of the N-terminal Amphipathic a-Helix Domain of the Fungal Immunomodulatory Protein from Ganoderma tsugae （Fip-gts） Defined by a Yeast Two-hybrid System and Site-directed Mutagenesis[J]. Boil. Chem，1997（8）：20044–20048.
[4] KO JL， HSU CI， LIN RH， et al. A new fungal immunomodulatory protein， FIP-fve isolated from the edible mushroom， Flammulina veltipes and it s complete amino acid sequence [J]. European journal of biochemistry FEBS， 1995 （228）：244-249.
[5] Jinn TR， Wu CM， Tu WC， Ko JL， Tzen JT （2006） Functional expression of FIP-gts[J]， a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma tsugae in Sf21 insect cells. Biosci Biotechnol Biochem 70：2627–2634
作者简介：张春玉（1972-），女，吉林省长春市，长春职业技术学院食品与生物技术分院教授，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究。