摘要 目的：观察慢性束缚应激抑郁症大鼠模型中海马自噬标志蛋白Belin1及LC3的表达变化情况，探讨逍遥散对其的调节作用。方法：20只Wistar大鼠随机分为4组（n=5）：正常组、模型组、逍遥散组、氟西汀组。采用21 d慢性束缚应激方法建立抑郁症大鼠模型，利用免疫组织化学方法检测大鼠海马CA3区Belin1、LC3表达情况。结果：Belin1、LC3在各组中较正常组均有较明显的表达（P<0.05）。与模型组相比，逍遥散能明显下调Belin1、LC3的表达（P<0.05）。结论：慢性束缚应激抑郁症大鼠海马自噬相关蛋白Belin1、LC3表达有变化，提示自噬可能是抑郁症发病机制之一，且逍遥散治疗抑郁症的机制可能与调节自噬标志蛋白Belin1、LC3有关。
关键词 逍遥散；抑郁症；自噬；Beclin1；LCA
Effects of Xiaoyaosan Decoction on the expression of Belin1 and LC3 inhippocampus of rats with depression induced by chronic restraint stress
Wang Tingye， Li Xiaojuan， Zhou Xueming， Pan Qiuxia， Chen Jiaxu
（School of Basic Medical Science， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
Abstract Objective：To observe the effects of Xiaoyaosan Decoction on the expression of Belin1 and LC3 in hippocampus of rats with depression induced by chronic restraint stress. Methods：A total of 20 Wistar rats were randomly divided into 4 groups：the control group， the model group， the Xiaoyaosan （XYS） group and the fluoxetine group. Depression model was established by 21day chronic restraint stress， and the expression of Belin1 and LC3 in CA3 of rats′ hippocampus was detected by immunohistochemistry. Results：There is significant differences between the control group and other groups （P<0.05）. Xiaoyaosan Decoction could dowegulated the expression of Belin1 and LC3 （P<0.05）. Conclusion：The expression of Belin1 and LC3 in hippocampus of rats with depression induced by chronic restraint stress indicated that autophagy may be part of the mechanism of depression. The effect of Xiaoyaosan Decoction on depression could be related to the regulation of Belin1 and LC3.
Key Words Xiaoyaosan Decoction； Depression； Autophagy； Beclin1； LCA
中圖分类号：R228文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.007
随着社会压力的增加，抑郁症的患病率也逐年增加，抑郁症现已成为临床常见的精神疾病之一。抑郁症属于中医郁证、百合病等的范畴，临床表现以情绪低落为主要特征，严重时甚至伴随幻觉妄想和自杀倾向。世界卫生组织于2001年将重度抑郁症（Major Depressive Disorder，MDD）列为导致生活残疾的第一大原因。临床及基础研究对于抑郁症的相关机制、治疗方法也逐渐深入。近年研究表明抑郁症患者大脑中海马、杏仁核等部位出现明显的萎缩、体积缩小现象。已有研究提出自噬与抑郁症之间具有联系，海马部位的萎缩及海马神经元的凋亡可能与自噬有关[14]。自噬（autophagy）是一种自我消灭的机制（selfeating mechanism），对于聚集的蛋白质以及功能失调细胞器是关键的清洁机制[5]。在维持细胞内环境稳态中起着十分关键的作用。自噬对于大多数组织细胞均有重要作用，其在中枢神经系统中也发挥着重要作用。LC3与Beclin1是2种具有代表性的自噬标志蛋白，LC3参与自噬体膜的形成[6]，Beclin 1则是细胞自噬的一个关键调控因子，是自噬体形成不可或缺的条件[7]。逍遥散作为中医传统方剂，在治疗抑郁症方面也具有较好的疗效，对其治疗抑郁症的相关机制研究也多见报道[89]，现已成为治疗抑郁症的常用方剂。
我们课题组在前期研究中通过慢性束缚应激，成功建立了抑郁症大鼠模型的造模方法，且具有较好的稳定性[10]。本实验通过慢性束缚应激方法建立抑郁症大鼠模型，观察抑郁症大鼠海马自噬标志蛋白Belin1、LC3的表达变化以及中药复方逍遥散对其的调节作用，探讨慢性束缚应激抑郁症大鼠海马相关自噬蛋白表达变化，为揭示抑郁症的发病机制及逍遥散的治疗机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
SPF级雄性Wistar大鼠20只，4周龄，体质量（170±20）g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）20120001，实验在北京中医药大学屏障环境动物实验室进行[SYXK（京）20110024]。
1.1.2 试剂与仪器
试剂：PBS溶液（Solarbio），4%多聚甲醛溶液（0.1 μmol/L的PBS溶液配制，pH为7.4），AntiBeclin 1 antibody ab62557，AntiLC3A/B anti body ab58610（abcam）；抗体稀释液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；羊抗兔二抗工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二甲苯（北京化工厂），无水乙醇（北京化工厂）。
仪器：大鼠束缚架：自制T型束缚台：底座宽10 cm、长20 cm、厚2.8 cm，上端束缚台长22 cm，最宽处6.6 cm，前端有固定头部的小架和适合四肢放置的凹槽，上端束缚台有两条可调节的粘贴软带。显微镜Nikon E200（Nikon，Japan），正置智能型显微镜及采集系统（奥林巴斯（中国）有限公司）
1.2 方法
1.2.1 动物与分组 大鼠均在SPF级动物实验室饲养。适应性饲养1周后，按照体重随机分为4组：正常组、模型组、逍遥散组、氟西汀组，每组5只。
1.2.2 药物制备 实验所用逍遥散源于《太平惠民和剂局方》，按照原方比例购买柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜共4 200 g原药材。上述药材均购于北京同仁堂有限公司。严格按照制备工艺制成逍遥散干浸膏备用，使用时用生理盐水按照所需浓度进行配制。盐酸氟西汀胶囊（生产厂：Patheon France；分包装厂：礼来苏州制药有限公司；批号：0955A），规格20 mg/粒（成人用药量为20 mg/d），给药时按大鼠用药量进行换算。
1.2.3 模型制备 抑郁症大鼠模型的建立采用本课题所建立的稳定的21 d慢性束缚应激方法，即将模型组、逍遥散组及氟西汀组大鼠每日在随机时间点进行束缚，每次3 h，连续束缚21 d，正常组不进行束缚，仅在相同的时间段内禁食禁水。
1.2.4 药物干预 在慢性束缚应激造模开始后，逍遥散组大鼠每日灌服逍遥散，氟西汀组每日灌服盐酸氟西汀，按人体用药大鼠等效剂量换算后作为大鼠用药量[9]。大鼠用逍遥散的量=6.17（系数）×生药/60 kg（一般成人体质量）×药物提取率（实际干粉量/实际生药量），计算得出本实验中逍遥散组大鼠的给药量为3.854 g/（kg·d），1次/d，给药体积为1 mL/100 g体质量。氟西汀组大鼠给药量为。模型组与正常组大鼠灌服等量生理盐水作为对照。
1.2.5 免疫组化检测 各组大鼠在21 d束缚结束之后，随机选取5只用4%多聚甲醛灌注固定后制备大脑石蜡切片。切片脱蜡、水化后，滴加3%H2O2去离子水室温静置10 min阻断内源性过氧化物酶，用PBS溶液冲洗2 min×3次，进行抗原修复后PBS溶液浸泡3 min×3次，室温下用羊血清孵育30 min。滴加一抗50 μL 4 ℃过夜，室温复温1 h后用PBS溶液冲洗3 min×3次；滴加二抗50 μL，室温孵育10 min，PBS溶液冲洗3 min×3次。在显微镜下滴加DAB工作液顯色，镜检控制直至显色满意后流水冲洗终止显色反应。将切片置于苏木素中复染，常规脱水透明后封片。每只动物选取3张切片，每张切片随机选取3个视野进行观察。计数每个视野有棕黄色颗粒的阳性细胞，取其均值进行统计分析。
1.3 统计学方法 数据以均数±标准差（±s）表示。运用SPSS 20.0软件，对数据做正态性检验和方差齐性检验，两项均符合，采用单因素方差分析（OneWay，ANOVA）进行统计计算。若数据不正态或方差不齐，则采用K个独立样本的非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠海马CA3区Beclin1表达情况
实验结果表明，除正常组外其他3组均可见Beclin1在大鼠海马CA3区有明显阳性表达，正常组有少量表达。与正常组相比，其他3组大鼠海马CA3区Beclin 1表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，逍遥散组与氟西汀组表达量有减少，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 大鼠海马CA3区LC3表达情况
实验结果表明，除正常组外其他3组均可见LC3在大鼠海马CA3区有阳性细胞表达，正常组有少量表达。与正常组相比，其他3组大鼠海马CA3区LC3表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，逍遥散组与氟西汀组表达量有减少，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
正常细胞的生长发育需要一个对蛋白质合成和降解之间的平衡进行调节的过程，真核细胞具有2种主要的降解途径：泛素蛋白酶体途径和自噬（Autophagy）途径。自噬可分为大自噬（Macroautophagy）、小自噬（Microautophagy）、分子伴侣介导的自噬（Chaperonmediated Autophagy，CMA）等类型[11]。不同类型的自噬其发生过程不同，参与的蛋白分子也不同，Belin1、LC3是自噬过程中2种常见的自噬体标志物[6]。Beclin 1是酵母自噬相关基因Atg6/Vps30的哺乳动物同源基因，是首个被鉴定的介导哺乳动物自噬的基因，其最主要的作用在于调控自噬体膜的合成[12]。LC3参与了自噬体膜的形成，包括2种可相互转化的形式即LC3I和LC3II。细胞内新合成的LC3经过加工，成为胞质可溶形式的LC3I，后者经泛素化加工修饰，与自噬体膜表面的PE结合，成为膜结合形式的LC3II。LC3II定位于前自噬体和自噬体，是自噬体的标志分子，随自噬体膜的增多而增加[13]。MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C是大鼠Map1LC3的3种亚型，这3种亚型在不同的人类组织中存在不同的表达模式，研究表明MAP1LC3的3种亚型在翻译后修饰中存在差异[14]。针对抑郁症发病机制的相关研究表明抑郁症患者存在海马神经元凋亡的情况，自噬能对应激状态下的神经元起到保护作用，实验研究表明在化学诱导的长期抑郁症细胞模型中存在LC3II这一自噬标志物的上调[15]。抗抑郁药阿米替林（AMI）和选择性5羟色胺再摄取抑制剂西酞普兰（CIT）能增加自噬标志物LC3II和Beclin1在抑郁症患者体内的表达[16]。
已有文献报道证明发生抑郁症时海马神经元接受的应激能导致自噬发生[17]，且氟西汀能下调慢性不可预知应激（CUMS）抑郁大鼠细胞自噬关键基因Beclin1和LC3的mRNA及蛋白表达[18]。提示自噬现象与抑郁症的发生关系紧密在本实验中，通过慢性束缚应激造模方法建立抑郁症大鼠模型，采用氟西汀作为阳性对照药验证抑郁症模型。在成功建立慢性束缚应激抑郁症大鼠模型后，采用逍遥散干预。实验结果证明在慢性束缚应激抑郁症大鼠海马CA3区2个自噬标志蛋白Beclin1、LC3表达均较正常组明显增多，说明在抑郁症大鼠海马存在自噬现象，提示自噬可能是抑郁症的发病机制之一，且Beclin1和LC3在其海马自噬中发挥作用。在课题组前期研究已发现中药传统方剂逍遥散对于抑郁症有较好的治疗效果，试验中采用逍遥散干预治疗之后发现逍遥散能下调慢性束缚应激抑郁症大鼠海马CA3区Beclin1和LC3的表达，提示逍遥散治疗抑郁症的机制可能是通过调节2个自噬标志蛋白从而抑制自噬现象。然而本实验仍有不足之处，未通过电镜观察海马神经元超微结构改变直观地观察模型大鼠海马部位的神经元凋亡以及自噬现象。同时在本实验基础上运用RTPCT及Western Blotting测定海马Belin1、LC3基因及蛋白表达变化情况能更清晰地从多角度多层次说明自噬相關蛋白Belin1、LC3在慢性束缚应激抑郁症大鼠海马中的变化，从而揭示其与自噬在抑郁症发病机制中的作用。希望在今后的工作中能进一步完善研究。
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（2017-02-20收稿 责任编辑：洪志强）