基金项目：973项目（2005CB724602）和中科院重要方向性项目（KSCX-2-SW-228和KSCX1-YW-R-64）
作者单位：200050 上海市长宁区同仁医院（金立）；中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室（秦文明，金由辛）
通讯作者：秦文明
【摘要】 目的 探讨在两株胃癌细胞株BGC-823及SGC-7901中抑制内源性miR-24的表达后对细胞凋亡和增殖的作用。方法 使用INTERFERin转染试剂将锁核苷酸标记的反义核酸miR-24-ASO转染进入胃癌细胞株，使用倒置荧光显微镜观察细胞生长变化，流式细胞计检测细胞凋亡的比例，然后使用CCK-8试剂盒对细胞增殖情况进行检测。结果 转染miR-24-ASO的BGC-803细胞和SGC-7901细胞相对于转染内参的凋亡水平分别增加了约2.5倍和2.1倍左右。转染了miR-24-ASO抑制内源性miR-24的表达之后细胞的增殖能力相对于转染阴性对照的细胞株的增殖能力均明显降低。结论 抑制内源性miR-24的表达可以诱导胃癌细胞的凋亡并导致胃癌细胞增殖能力的降低。miR-24调控了胃癌细胞的增殖和凋亡过程。揭示了miRNA在胃癌发生过程中的调控机制，并为胃癌的治疗提供了良好的应用前景。
【关键词】 miR-24； miR-24-ASO； 胃癌； 凋亡； 治疗应用
The influence of miR-24 togastic cancercell line BGC-803 and SGC-7901 apoptosis and proliferation *JIN Li,QIN Wen-ming,JIN You-xin.*Tongren Hospital of changning District,Shanghai 200050,China
【Abstract】 Objective To Explove the two cancer line BGC-803 and SGC-7901 in the inhibition of endogenous miR-24 after the expression of apoptosis and proliferation.Methods miR-24-ASO was transfected into BGC-803 and SGC-7901 cells with transfection agent to down-regulate the expression of endogenous miR-24. The cellular growth activity was assayed by CCK-8 kit, and the apoptosis was tested by flow cytometry.Results The apoptosis rates of BGC-803 and SGC-7901 cells transfected with miR-24-ASO were about 2.5 and 2.1 times more than which transfected with negative control NC-ASO. The ability of proliferation of BGC-803 and SGC-7901 cells was greatly reduced after miR-24 was down-regulated by miR-24-ASO.Conclusion The miR-24 down-regulation can suppress the cellular proliferation and induce apoptosis in BGC-803 and SGC-7901 cells. miR-24 regulates cell proliferation and apoptosis in gastric cancer cells. And it may have a strong rationale for therapeutic applications in gastric cancer in the future.
【Key words】 MiR-24； MiR-24-ASO； Gastric cancer； Apoptosis； Therapeutic applications
microRNA（miRNA）是不能编码蛋白质的一类内源性小分子RNA。它们通过与编码蛋白质基因的mRNA互补结合进行转录后的调控［1］。miRNA在动植物中通过降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的蛋白翻译行使着许多重要的功能。目前的研究已经发现miRNA在发育、细胞分化、胚胎生成、细胞周期调控以及细胞凋亡等许多生命活动中发挥着重要的作用。另外，miRNA还与心脑血管、神经系统疾病以及癌症等许多疾病的发生有着密切的关系［2～4］。
许多研究已经发现miRNA在多种癌组织中相对于正常组织有着异常的表达水平，这些miRNA影响着肿瘤的增殖和凋亡，它们可能起到了原癌基因或抑癌基因的作用［5］。胃癌是人类常见的一种恶性肿瘤，在胃癌中也已经发现了许多异常表达的miRNA，其中miR-24在胃癌组织中的表达水平明显升高。提示miR-24在胃癌的发生发展过程中起到重要的作用［6～8］。本文通过转染锁核酸标记的miR-24反义核酸miR-24-ASO降低内源性miR-24在两株胃癌细胞株SGC-7901和BGC-803细胞中的表达水平。结果发现在这两株胃癌细胞株中抑制内源性miR-24的表达可以诱导这两株细胞发生凋亡。进一步对抑制内源性miR-24之后胃癌细胞株的增殖情况进行检测，结果发现使用反义核酸miR-24-ASO抑制内源性的miR-24表达之后的胃癌细胞株的增殖能力均明显降低。这些结果表明miR-24调控了胃癌细胞的增殖和凋亡。使用miR-24反义核酸抑制内源性的miR-24表达对胃癌的治疗有着重要的应用前景。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 SGC-7901、BGC-803细胞均购自中科院上海生科院细胞库。细胞在添加了10%胎牛血清（Sigma），100 μg/μL青霉素-链霉素双抗（Sigma）的RPMI-1640培养基（水生生物）中37 ℃下5%二氧化碳环境中传代培养。转染所用细胞培养基中不加入青霉素-链霉素双抗。
1.2 细胞转染 细胞在大约70%密度下使用INTERFERin （Polyplus）转染试剂进行转染。根据商家提供的标准操作步骤对合成的锁核苷酸标记的miRNA反义核酸（miR-24-ASO）及阴性对照（NC-ASO）进行转染。转染后不同的时间点收集细胞并进行下一步的分析。使用的反义核酸序列如下：LNA NC-ASO,5" caCTTATCagtcAGACCAtcGT 3"；LNA 24-ASO,5" ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA 3"（小写字母表示锁核酸标记位点）。
1.3 细胞增殖分析 使用CCK-8试剂盒（Dojindo）对转染后的细胞增殖情况进行分析。细胞在24孔板中按每孔约5×104个细胞进行铺板，使用生长培养基培养。然后12孔中转染20 nM的miR-24-ASO，同时另外12孔中转染20 mM的NC-ASO作为对照。分别在转染1、2、3、4 d后加入10 μL CCK-8检测试剂，反应2 h候吸取上清液，在分光光度计下检测450 nm下的吸收光，每次检测取三个复孔。使用sigmaplot软件作出转染后细胞的增殖曲线。
1.4 细胞凋亡流式细胞分析 使用流式细胞Annexin-V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒（Sigma），对转染后的胃癌细胞进行凋亡分析。细胞转染miR-24-ASO或NC-ASO寡核苷酸48 h后收集细胞，使用垂直离心机以4000 r/min转速离心5 min收集细胞。使用PBS缓冲液洗两遍后加入300 μL的结合缓冲液重悬细胞，然后加入2 μL的Annexin V-FITC和4 μL的PI染料进行染色。染色10 min后进行流失细胞仪进行细胞凋亡分析。使用WinMDI软件分析转染后细胞凋亡的变化。
2 结果
2.1 抑制miR-24的表达可以诱导胃癌细胞BGC-803、SGC-7901发生凋亡 使用INTERFERin转染试剂向胃癌细胞株BGC-803和SGC-7901分别转染20 mM锁核苷酸标记的miR-24反义核酸miR-24-ASO，以抑制内源性miR-24的表达水平，同时转染20 mM的NC-ASO作为参照。在转染48 h之后，分别使用倒置显微镜观察细胞的生长状况。结果发现，使用miR-24-ASO转染的细胞相对于转染阴性内参细胞的凋亡水平在BGC-803和SGC-7901两个胃癌细胞株中都发生了明显了增加（图1）。进一步验证抑制miR-24的表达对胃癌细胞凋亡情况的影响，笔者收集了培养基中的细胞并用胰酶消化贴壁的细胞，使用PBS缓冲液洗涤后，使用结合缓冲液重悬细胞，然后加入Annexin V-FITC和PI染料进行染色。接下来使用流式细胞仪对转染后细胞的凋亡水平进行定量分析。结果发现相对于转染内参的细胞，抑制miR-24表达以后的两个胃癌细胞株的凋亡水平均出现了明显的增多（图2A）。使用Sigmaplot软件对三次重复的结果进行统计分析，结果发现转染miR-24-ASO的BGC-803细胞相对于转染内参的凋亡水平增加了约2.5倍，转染miR-24-ASO的SGC-7901细胞相对于转染内参的凋亡水平也增加了约2.1倍左右。计算得到的P值分别为0.000和0.018，均具有统计学意义（图2B）。
2.2 抑制miR-24的表达可以降低胃癌细胞SGC-7901、BGC-803的增殖能力 使用CCK-8试剂盒对转染后的细胞增殖情况进行分析。细胞铺板后使用生长培养基培养。然后分别转染20 nM的miR-24-ASO和20 mM的NC-ASO。分别在转染1、2、3、4 d后加入10 μL CCK-8检测试剂，反应2 h后吸取上清液，在分光光度计下检测450 nm下的吸收光，每次检测取三个复孔。使用sigmaplot软件作出转染后细胞的增殖曲线。结果显示在两个胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901中，转染了miR-24-ASO抑制内源性miR-24的表达之后细胞的增殖能力相对于转染阴性对照的细胞株的增殖能力均明显降低（图3）。
3 讨论
miRNA是最近发现的生物体内源表达的一类非编码蛋白的RNA调控因子。随着研究的深入，发现越来越多的这类小分子非编码RNA在生物体内参与了的生物进程。目前已经知道miRNA与细胞周期、增殖、凋亡、分化和发育等多种生物进程相关［1］。最近的研究也证明，miRNA在许多疾病（如糖尿病、心脑血管疾病和癌症等）中有着异常的表达，更多的证据进一步证明miRNA参与了这些疾病的发生发展过程［9～11］。近年来，miRNA在肿瘤发病中的作用受到人们的关注。研究发现，50%以上的miRNA基因定位在与肿瘤相关的区域，及多种肿瘤中均存在miRNA异常表达［12］。许多实验也证明了miRNA可以通过靶向重要的细胞生长调控因子作为癌基因或者抑癌基因行使功能［13］。尽管miRNA在癌症发生过程中的机制研究还不是非常明了，许多研究已经可以通过已知的miRNA知识对癌症做出诊断，甚至通过超表达或已知miRNA的表达对癌症进行治疗。这为揭示癌症的发病机制以及癌症的治疗提供了重要的理论和实践基础。
细胞凋亡是多细胞生物体中的细胞程序性死亡的一种形式。细胞凋亡体现为细胞内一系列生化指标的变化、细胞的形态变化以及细胞的死亡。越来越多的证据表明miRNA能够在发育过程中以及其他一些生物进程中调控细胞的凋亡，同时也发现了一些与凋亡相关的miRNA［14,15］。例如miR-15和miR-16能够通过靶向抗凋亡因子Bcl-2参与细胞凋亡过程［16］。miR-29可以通过结合到Mcl-1的3"非翻译区并抑制其蛋白翻译而参与细胞凋亡的调控过程［17］。另外，miRNA还可以通过调控已下抑癌基因或者癌基因参与细胞凋亡的调控。研究发现，miR-21可以通过靶向PDCD4，TPM1及PTEN等蛋白基因参与调控细胞凋亡过程［18～20］。
胃癌预后差，病死率高的一个很重要原因是胃癌细胞自身存在的或在使用化疗药物后获得的多药耐药性。在肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生过程中,miRNA也发挥了重要的作用。Xia等通过研究发现了一系列miRNA它们在胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR中存在着表达差异。而且,在表达下调的miRNA中,miR215和miR216通过调控其靶基因-凋亡抑制基因Bcl-2,在胃癌细胞多药耐药性的发展中发挥重要作用［21］。目前,围绕胃癌的miRNA研究已经展开,并不断深入。几个基于芯片技术和生物信息学方法的研究,已发现了一些与胃癌关系密切的miRNA。其中miR-21和miR-24在胃癌组织中都有着明显的异常表达升高［7］。表明这两个miRNA与胃癌的发生有着重要的关系。研究也已经证明了miR-21在胃癌细胞的增殖和迁移等生物过程中起着重要的作用。许多研究发现miR-24参与了许多细胞的增殖和凋亡过程［22］。miR-24可以通过靶向抑癌基因p16（INK4a）的蛋白翻译对细胞增殖进行调控［23］。同时miR-24还在视网膜神经发育过程中起到了抑制细胞凋亡的作用［24］。这些研究都表明miR-24可能参与了胃癌细胞的增殖和凋亡。
在本文中，笔者通过转染锁核苷酸标记的miR-24的翻译核酸miR-24-ASO抑制胃癌细胞株BGC-823和SGC-7901中的内源性miR-24的表达，发现胃癌细胞株在内源性miR-24表达水平下调后出现了明显的凋亡。同时抑制内源性miR-24的表达后这两株胃癌细胞的增殖能力也明显减弱。证明了miR-24调控了胃癌细胞的增殖和凋亡过程。揭示了miRNA在胃癌发生过程中的调控机制，并为胃癌的治疗提供良好的应用前景。
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（收稿日期：2011-03-17）
（本文编辑：王春芸）