[摘要] 目的 研究三氧化二砷（As2O3）联合维A酸对恶性黑色素瘤细胞株A375的增殖、迁移能力影响及其可能的分子机制。 方法 常规培养黑色素瘤细胞株A375，分为空白对照组（不含药物的DMEM处理）、As2O3组（10 μmol/L As2O3）、全反式维A酸（at-RA）组（10 μmol/L at-RA）、As2O3+at-RA组（10 μmol/L As2O3联合10 μmol/L at-RA）。MTT法检测细胞活力，划痕试验检测细胞迁移能力，Western-blot法检测MMP-2、Caspase-2的蛋白水平。 结果 ①As2O3+at-RA组的细胞活力为（35.8±7.3）%，低于As2O3组的（62.4±10.3）%和at-RA组的（59.3±11.3）%，差异有统计学意义（P < 0.05）；②As2O3+at-RA组的迁移能力相对值为（21.3±6.3）%，低于As2O3组的（55.4±9.5）%和at-RA组的（57.1±10.4）%，差异有统计学意义（P < 0.05）；③As2O3+at-RA组的Caspase-2蛋白含量为（274.1±42.4）%，高于As2O3组（175.2±29.4）%和at-RA组（181.4±23.8）%；As2O3+at-RA组的MMP-2蛋白含量为（36.2±8.2）%，低于As2O3组（64.2±10.4）%和at-RA组（62.7±9.4）%。 结论 As2O3和at-RA联合应用能够抑制黑色素瘤细胞株A375的增殖和迁移能力，这一作用可能是通过上调Caspase-2、下调MMP-2来发挥的。
[关键词] 黑色素瘤；三氧化二砷；维A酸；增殖；迁移
[中图分类号] R739.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（b）-0028-04
Effects of arsenic trioxide and retinoids on proliferation and migration of melanoma cell line A375 and its mechanism
ZHANG Haipeng
Department of Dermatological， Yuhang District Maternal and Child Care Service Centre， Zhejiang Province， Hangzhou 311100， China
[Abstract] Objective To study the effect of arsenic trioxide （As2O3） and retinoids on proliferation and migration of melanoma cell line A375 and its mechanism. Methods Melanoma cell line A375 were cultured and divided into vacuity contrast group （treated with DMEM）， As2O3 group （treated with 10 μmol/L As2O3）， at-RA group （treated with 10 μmol/L at-RA）， As2O3+at-RA group （treated with 10 μmol/L As2O3 and 10 μmol/L at-RA）. Then vitality was detected by MTT， migration was detected by wound-healing assay and protein level of MMP-2， Caspase-2 were detected by Western-blot. Results ①Cell vitality value of As2O3+at-RA group [（35.8±7.3）%] was lower than As2O3 group [（62.4±10.3）%] and at-RA group [（59.3±11.3）%]. ②Migration relative value of As2O3+at-RA group [（21.3±6.3）%] was lower than As2O3 group [（55.4±9.5）%] and at-RA group [（57.1±10.4）%]. ③Caspase protein level of As2O3+at-RA group [（274.1±42.4）% ]was higher than As2O3 group [（175.2±29.4）%] and at-RA group [（181.4±23.8）%]； MMP-2 protein level of As2O3+at-RA group [（36.2±8.2）%] was lower than As2O3 group [（64.2±10.4）%] and at-RA group [（62.7±9.4）%]. Conclusion As2O3 combined with at-RA can reduce the migration and proliferation ability of melanoma cell line A375， and down-regulation of MMP-2， up-regulation of Caspase-2 may be its possible molecular mechanism.
[Key words] Melanoma； Arsenic trioxide； Retinoids； Migration； Proliferation
黑色素瘤是一类具有高度恶性生物学行为的皮肤肿瘤，来源于皮肤基底部的黑色素细胞。近年来，我国的黑色素瘤发病率不断升高，年发病例数已超过10 000例[1]。早期发现的患者可通过手术切除；中晚期患者则缺乏有效的治疗手段，手术切除困难，化疗效果不佳。基于黑色素瘤增殖、迁移等恶性生物学行为，探寻能够抑制该生物学行为的治疗方式具有积极的临床应用前景[2]。本研究通过培养恶性黑色素瘤细胞株A375来分析三氧化二砷（As2O3）联合维A酸对其增殖、迁移能力影响及其可能的分子机制，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 材料
恶性黑色素瘤细胞株A375购买于中科院细胞库；DMEM培养基和胎牛血清均购买于Gbico公司；抗体购买于Abcam公司；离心管和细胞培养板购买于Corning公司；全反式维A酸（at-RA）、As2O3等药品购买于Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞复苏和培养方法 将细胞从液氮罐中取出后迅速置于37℃水浴锅中，并将细胞悬液移入15 mL离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清后用5 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，移入培养瓶中在37℃、5%CO2孵箱中培养。当细胞铺满70%～80%且处于对数生长期时，用胰酶常规消化，传代并接种于12孔板。
1.2.2 细胞处理方法 当12孔板内细胞铺满70%～80%后，将含血清的DMEM更换为不含血清的DMEM培养24 h，而后分别用不含药物的DMEM（空白对照组）、10 μmol/L As2O3（As2O3组）、10 μmol/L at-RA（at-RA组）、10 μmol/L As2O3联合10 μmol/L at-RA（As2O3+at-RA组）处理。24 h后进行相应检测。
1.2.3 MTT法 药物处理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培养基、40 μL 0.5%MTT溶液，孵箱中继续培养4 h，而后吸尽上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡10 min，而后在酶标测仪上检测490 nm处的吸光值，计算细胞活性。其中，以空白对照组细胞的增殖能力为100%，分别计算As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组细胞增殖能力的相对值。
1.2.4 划痕试验 加药处理同时用无菌的200 μL枪头沿细胞孔中央在孔底部做一划痕，于镜下观察并拍照记录（0 h）；放回孵箱继续培养24 h，而后取出培养板于镜下观察并拍照记录（24 h）。所得图像用Image J分析，计算0 h和24 h时划痕的面积A0和A24，以（A0-A24）/A0反映细胞的迁移能力。其中以空白对照组细胞的迁移能力为100%，分别计算As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组细胞迁移能力的相对值。
1.2.5 Western-blot法 在细胞孔内加入60 μL蛋白裂解液RIPA，用细胞刮刀刮碎细胞后转移至1.5 mL离心管内，于4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清通过BCA法进行蛋白浓度定量，上样量按每孔80 mg总蛋白计算。配置4%的浓缩胶和10%的分离胶，点样后进行100 V、20 min，120 V、90 min的垂直电泳和100 V、90 min的电转膜。完成后取出NC膜投入5%脱脂牛奶中，室温封闭2 h，而后在TBST溶液中震荡洗涤5 min×3遍，根据分子量裁剪NC膜并分别加入2%BSA溶液配置的1∶1000的MMP-2、Caspase-9、actin第一抗体，4℃摇床孵育过夜。第2天取出NC膜，TBST溶液中震荡洗涤5 min ×3遍，加入5%脱脂牛奶配置的1∶1000的HRP标记的种属特异行第二抗体、室温孵育2 h后在TBST溶液中震荡洗涤10 min ×3遍。最后进行显影。计算蛋白条带的灰度值，以Tob灰度值/actin灰度值作为蛋白含量，令对照组的目的基因蛋白含量的均值为100%，计算As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组的蛋白含量。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖能力
As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组的细胞活力分别为（62.4±10.3）%、（59.3±11.3）%、（35.8±7.3）%，均低于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），且As2O3+at-RA组的细胞活力低于 As2O3组和at-RA组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1、图1。
与空白对照组比较，*P < 0.05；与As2O3+at-RA组比较，#P < 0.05
图1 不同处理组A375细胞的细胞活力情况
2.2 细胞迁移能力
四组细胞0 h和24 h时的划痕情况见图2，As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组的迁移能力相对值分别为（55.4±9.5）%、（57.1±10.4）%、（21.3±6.3）%，均低于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），且As2O3+at-RA组的迁移能力相对值低于As2O3组和at-RA组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
2.3 Caspase-2及MMP-2蛋白表达情况
As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组的Caspase-2蛋白含量分别为（175.2±29.4）%、（181.4±23.8）%、（274.1±42.4）%，MMP-2蛋白含量分别为（64.2±10.4）%、（62.7±9.4）%、（36.2±8.2）%，均低于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；且As2O3+at-RA组的Caspase-2蛋白水平高于As2O3组和at-RA组，MMP-2含量低于As2O3组和at-RA组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3、4、表1。
图3 各组Caspase-2及MMP-2蛋白表达Western-blot条带
与空白对照组比较，*P < 0.05；与As2O3+at-RA组比较，#P < 0.05
图4 各组Caspase-2及MMP-2蛋白表达相对值
表1 不同处理条件对细胞增殖能力、迁移能力以及蛋白含量的影响（%，x±s）
注：与空白对照组比较，*P < 0.05；与As2O3+at-RA组比较，#P < 0.05
3 讨论
As2O3是一类促进肿瘤细胞凋亡的诱导剂，能够通过促进凋亡相关基因表达，抑制端粒酶活性，影响细胞周期蛋白含量，改变线粒体膜电位等来发挥促凋亡作用[3]。已有研究报道了As2O3具有诱导黑色素瘤细胞凋亡的作用，其对细胞增殖活性的抑制率达到了50%～60%[4]。维A酸是维生素A在体内的代谢产物或衍生产物，包括全反式维A酸、13顺维A酸、9顺维A酸3种，对上皮组织和细胞的生长、分化等均起到调节作用[5]。目前的研究认为，维A酸具有诱导黑色素瘤细胞凋亡的作用，且以全反式维A酸的作用最为明显，对细胞增殖的抑制率最高可达65%[6]。
尽管As2O3和维A酸能够促进黑色素瘤细胞的凋亡，但在两种药物单独应用时并不能完全阻断肿瘤细胞的增殖过程，因而无法有效控制黑色素瘤的发展和浸润。国外Ribeiro等[7]的研究用As2O3和维A酸共同处理黑色素瘤细胞株，结果发现两种能够在抑制肿瘤增殖和迁移方面发挥协同作用。近年来，国内也逐步开展了关于黑色素瘤生物学行为方面的研究，张国强等[8]和牛新武等[9-10]分别报道了As2O3和维A酸对黑色素瘤细胞生物学行为的调节作用，但是关于两种药物联合应用仍缺乏相关的研究。
本研究采用As2O3和维A酸共同处理黑色素瘤细胞株A375，探讨其对肿瘤增殖、迁移能力的影响，并为临床寻找有效的治疗途径提供参考。本研究中，分别通过MMT法和划痕试验来检测药物处理后A375细胞株的增殖和迁移能力。由结果可知，As2O3组、at-RA组的增殖和迁移能力均低于空白对照组，这与其他研究的结果相一致，即As2O3和维A酸单独应用均能抑制黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力。进一步通过比较As2O3+at-RA组与As2O3组、at-RA组的细胞增殖和迁移能力可知，两种药物联合应用能够更为明显的降低细胞的迁移和增殖能力。
目前，对于As2O3和at-RA酸抗肿瘤的机制尚未阐明，其潜在的分子作用靶点仍处于未知状态[11]。探寻在黑色素瘤细胞增殖、迁移过程中的关键分子，有助于寻找更有效的生物治疗靶点[12]。MMP-2是金属蛋白酶家族的分子，能够参与细胞外基质的讲解过程，进而促进肿瘤细胞向周围的浸润，其含量与肿瘤的浸润能力呈正相关[13-14]；Caspase-2则是执行细胞凋亡功能的重要分子，通过下游PI3K、ERK、NF-Kb等信号通路来介导，其含量与肿瘤的增殖能力呈负相关[15-16]。本研究通过Western-blot的方法检测不同处理组间MMP-2、Caspase-2的含量可知，As2O3和at-RA处理均能上调Caspase-2、下调MMP-2的表达，并且两者具有协同作用，当联合给药时，Caspase-2的表达得到了更为明显的促进，MMP-2的表达则得到了更为明显的抑制。这就说明上调Caspase-2、下调MMP-2可能是As2O3和at-RA发挥抗肿瘤作用的机制，同时也为临床寻找黑色素细胞瘤的治疗提供了新的分子靶点。
综上所述，As2O3和at-RA联合应用能够抑制黑色素瘤细胞株A375的增殖和迁移能力，这一作用可能是通过上调Caspase-2、下调MMP-2来发挥的。
[参考文献]
[1] 梅寒芳，金小宝，朱家勇.防御素2在恶性黑色素瘤B16细胞中的稳定表达及其生物学效应研究[J].第三军医大学学报，2011，33（14）：1467-1470.
[2] 练炼，马德亮，陶敏.恶性黑色素瘤的分子靶向治疗进展[J].实用肿瘤杂志，2010，25（2）：109-112.
[3] Chen MJ，Yang PY，Ye YZ，et al. Arsenic trioxide induces apoptosis in uveal melanoma cells through the mitochondrial pathway[J]. Am J Chin Med，2010，38（6）：1131-1142.
[4] Hiwatashi Y，Tadokoro H，Henmi K，et al. Antiproliferative and anti-invasive effects of inorganic and organic arsenic compounds on human and murine melanoma cells in vitro [J]. J Pharm Pharmacol，2011，63（9）：1202-1210.
[5] Venè R，Castellani P，Delfino L，et al. The cystine/cysteine cycle and GSH are independent and crucial antioxidant systems in malignantmelanoma cells and represent druggable targets [J]. Antioxid Redox Signal，2011，15（9）：2439-2453.
[6] Asgari MM，Brasky TM，White E. Association of vitamin A and carotenoid intake with melanoma risk in a large prospective cohort [J]. J Invest Dermatol，2012，132（6）：1573-1582.
[7] Ribeiro MP，Silva FS，Paixao J，et al. The combination of the antiestrogen endoxifen with all-trans-retinoic acid has anti-proliferative and anti-migration effects on melanoma cells without inducing significant toxicity in non-neoplasic cells [J]. Eur J Pharmacol，2013，715（1-3）：354-362.
[8] 张国强，刘思源，耿春杰，等.三氧化二砷对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖及新癌基因PPO表达的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（3）：423-425.
[9] 牛新武，冯捷，彭振辉，等.维A酸对人类恶性黑色素瘤 A375细胞增殖的影响[J].第四军医大学学报，2005，26（18）：1680-1682.
[10] 牛新武，冯捷，彭振辉，等.维A酸诱导人类恶性黑色素瘤细胞株A375凋亡的受体机制研究[J].四川大学学报，2006，37（4）：538-541.
[11] 纪长伟，倪秀芹，贾立敏，等.B16黑色素瘤组织中上皮型钙黏附分子和S100蛋白的表达及意义[J].解剖学杂志，2007，30（6）：745-748.
[12] 李亚平，钟加滕，衣豪伟，等.小分子化合物S2诱导B16细胞凋亡及其机制的研究[J].中国实验诊断学，2012，16（2）：216-218.
[13] 王琰，陈旻静，张娟，等.皮肤恶性黑色素瘤组织中Kiss-和MMP-蛋白的表达[J].郑州大学学报，2012，47（4）：481-484.
[14] 张娟，陈旻静，王大伟，等.组织蛋白酶D和基质金属蛋白酶-9在皮肤恶性黑色素瘤中的表达[J].第三军医大学学报，2012，34（10）：1002-1005.
[15] 杨一飞，王昊，汪京峡，等.Genistein抑制Livin基因对恶性黑色素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响[J].南方医科大学学报，2012，32（8）：1163-1167.
[16] 赵建民，孙保存，刘艳荣，等.Caspase家族在肿瘤血管生成拟态形成过程中的作用[J].临床与实验病理学杂志，2011，27（11）：1181-1184.
（收稿日期：2013-11-14 本文编辑：程 铭）