摘 要：本试验旨在探讨A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌体外抑菌效果的影响。试验选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌三种常见致病菌作为指示菌，酸化剂A酸、C酸和酸无穷的浓度分别设置为0.4、0.5、0.7、0.9、1.1 g/mL，每个处理3个重复，通过牛津杯法测定抑菌圈大小，来评估不同浓度水平A酸、C酸、酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的体外抑菌效果。结果表明：A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌均产生显著的抑菌效果（P < 0.05），酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果显著优于A酸（P < 0.05），A酸和酸无穷对三种菌的抑菌效果均显著优于C酸（P < 0.05）；随着酸化剂的浓度升高，酸化剂的抑菌效果显著增强（P < 0.05）；不同浓度水平的酸化剂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果差异显著（P < 0.05）。1.1 g/mL酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好（P < 0.05），1.1 g/mLA酸对沙门氏菌的效果最好（P < 0.05）。
关键词：酸化剂；金黄色葡萄球菌；沙门氏菌；大肠杆菌；体外抑菌
前 言
使用抗生素具有残留性和耐药性等负面作用，为了维持养殖业高水平生产力，寻找抗生素替代物已成为动物营养研究领域的重点问题之一。
酸化剂安全、无污染、无残留，能够降低饲料和动物胃肠道中的pH值，主要是由有机酸、盐类和无机酸组成。不仅具有提高饲料利用率、改善动物生产性能的作用，还具有抑制有害微生物的活动和繁殖、促进有益菌的生长，改善动物胃肠道内微生物区系，保护动物胃肠道黏膜健康、增强动物免疫机能等作用[1]，作为抗生素替代品在畜禽养殖过程中得到了广泛应用。
研究表明，在饲料中添加柠檬酸，大肠杆菌的数量减少，乳酸杆菌的数量增加，仔猪腹泻率降低[10]。苯甲酸可以降低仔猪胃肠道pH值，并增加挥发性脂肪酸。富马酸是三羧酸循环有氧过程的重要组分，能调节机体内酶活性和能量代谢等一系列生化反应[13]。虽然目前有很多关于不同有机酸之间以及有机酸和复合酸之间抑菌效果的比较研究，但是对于复合酸化剂之间的抑菌效果的比较研究很少。通过把有机酸和无机酸结合，利用酸化剂解离度不同，在几种酸的协同作用下形成抑菌谱更广的复合酸化剂，来达到增强抑菌效果的目的[11，5]。此外，还有研究表明，复合酸化剂的种类和配比不同，对仔猪肠道微生物区系的影响也会有所不同[2，4]。本研究选用不同配比的复合酸化剂A酸、C酸和酸无穷，选取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌作为指示菌，通过体外实验评定3种复合酸化剂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果，为不同复配酸化剂在动物生产中的应用提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
A酸、C酸和酸无穷购自四川建奇饲料有限公司，酸化剂成分组成见表1。
1.2 试验菌种
金黄色葡萄球菌（ATCC65213）、沙门氏菌（ATCC21512）和大肠杆菌（ATCC83912）来自西南民族大学动物营养与饲料科学专业实验室。
1.3 试验仪器
BSA 124 S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；GHP-9270恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；牛津杯 内径（6.0±0.1）mm、外径（7.8±0.1）mm（成都市科隆化学品有限公司）；SW-CJ-2 FD无菌操作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；SYQ-DSX-280 B压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；THZ-98 C 恒温摇床机（上海一恒科学仪器有限公司）；DHG-9140 A电热恒温鼓风烘箱（上海三发科学仪器有限公司）；UV 1810 S分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；
1.4 试验方法
1.4.1 培养基的配制
琼脂培养基的配制：取琼脂3 g于锥形瓶中，加入超纯水至200 mL，置于灭菌锅在121 ℃条件下进行灭菌15 min。
液体培养基的配制：取胰蛋白胨3 g、氯化钠3 g、酵母粉1.5 g于锥形瓶中，加入超纯水至300 mL，置于灭菌锅121 ℃条件下进行灭菌15 min。
固体培养基的配制：取胰蛋白胨3 g、氯化钠3 g、酵母粉1.5 g、琼脂4.5 g于锥形瓶中，加入超纯水至300 mL置于灭菌锅121 ℃条件下进行灭菌15 min。
1.4.2 菌种的活化
从-70 ℃冰箱中取出冷藏的菌种，用接种环挑取一环菌落到20 mL液体培养基中，置于37 ℃、180 r/min摇床培养12 h。从第一次活化的菌液里取1 mL加到10 mL液体培养基中，经37 ℃、180 r/min摇床培养2 h，用紫外可见光分光光度计测定OD值，进行第二次活化，对菌液的摇床活化进行直至用紫外可见光分光光度计测量OD值达到0.5（0.45～0.55），记录数据，作为指示菌。
1.4.3 酸溶液的制备
分别称取0.16 g、0.20 g、0.28 g、0.36 g、0.44 g的A酸、C酸和酸无穷，用超纯水稀释至浓度依次为0.4、0.5、0.7、0.9、1.1 g/mL的酸溶液，随后进行水浴加热，加热后紫外灭菌备用。
1.4.4 抑菌试验
将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，置于无菌操作台冷却凝固后，在无菌条件下放入经过灭菌的牛津杯，轻轻按压，使牛津杯稳固。取指示菌液200 uL到灭菌后的液体培养基中摇匀，倒入稳固牛津杯的琼脂培养基中，待冷却后取出牛津杯。分别加入100 uL的各个浓度的酸溶液，每一浓度下的酸溶液设置3个重复。随后，置于GHP-9270隔水式恒温培养箱37 ℃下恒温培養6～9 h，观察出圈情况，待抑菌圈形成后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，计算平均值。
1.5 数据处理与统计分析
试验数据用SPSS软件分析，对不同酸化剂对三种菌抑菌效果的影响和不同浓度水平的酸化剂对三种菌抑菌效果的影响进行二因素方差分析，对不同浓度水平的A酸、C酸和酸无穷对三种菌抑菌效果的影响分别进行单因素方差分析，并用Duncan法进行多比较，结果采用平均值形式表示，其中P > 0.05表示差异不显著，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析
表2可知，A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果差异显著（P < 0.05）；酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果显著优于A酸和C酸（P < 0.05），A酸对沙门氏菌的抑菌效果显著优于C酸和酸无穷（P < 0.05）；不同浓度的A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果差异显著（P < 0.05），随着浓度水平提高，酸化剂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果增强（P < 0.05），浓度为1.1 g/mL时，酸化剂的抑菌效果最好；酸化剂种类和浓度二因素对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果有显著的互作影响（P < 0.05），浓度水平为1.1 g/mL的A酸对沙门氏菌的抑菌效果最好（P < 0.05），浓度水平为1.1 g/mL的酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好（P < 0.05）。
3 讨论
致病性金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌可引起畜禽肠道等疾病，是危害养殖业的重要病原。酸化剂具有抑制有害微生物的活动和繁殖、促进有益菌的生长，改善胃肠道内微生物区系，保护动物胃肠道黏膜健康、增强动物免疫机能等作用[1]。酸化剂的抑菌机制主要有两个方面。第一，酸通过自由扩散的方式进入菌体细胞，在细胞内解离出的氢离子和酸根离子不能通过自由扩散的方式跨膜，导致氢离子在胞内集聚，细胞质pH降低，迫使细菌通过主动运输释放细胞内氢离子，恢复胞质pH平衡，确保酶的作用，这个过程消耗大量ATP，与细菌正常生长代谢产生能量竞争。酸根离子聚集，改变胞内内环境，并通过细胞遗传信息传递干扰细菌的DNA合成、造成细菌代谢途径发生改变、细胞的代谢活性受到抑制[6]，此外，由于细胞内渗透压升高，细胞必须释放带负电荷的离子，如细菌生长所必需的前体物质来平衡胞内渗透压，从而抑制细菌正常生长。第二，未解离的有机酸可以与菌体膜发生作用，破坏了菌体膜的完整性，导致内容物外泄，动物胃肠道的pH值降低，病原菌的生长环境受到破坏，从而达到抑菌目的[1]。
在本试验结果中，A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果均为显著，验证了酸化剂的抑菌作用。其中，0.4 g/mL是A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度；随着浓度的增加，抑菌圈越大，抑菌效果越明显[9]。0.7 g/mL～1.1 g/mL时，A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌均有明显的抑菌效果；1.1 g/mL是最佳的抑菌浓度。
酸化剂主要由无机酸、有机酸和盐类组成。许多研究表明，将有机酸和无机酸混合可以产生互补协同效应，将在不同pH范围内作用的几种酸复合在一起，可以形成抑菌谱更广的复合酸化剂，增强抑菌效果[11]。
在本试验中，A酸、C酸和酸无穷均为复合型酸化剂，虽然三种酸化剂的成分组成有所区别，但均对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌有显著的抑菌效果。其中，苯甲酸对大多数微生物有抑制作用，在 pH值为5.0和5.5的条件下，高浓度的苯甲酸对大肠杆菌有明显地抑制效果[3]。富马酸是三羧酸循环有氧过程的重要组分，能调节机体内酶活性和参与能量代谢等一系列生化反应[13]，其作用机制主要是富马酸穿过微生物细胞膜阻止DNA的合成来减少微生物菌群，或者抑制微生物的三羧酸循环来达到抑菌的目的，因此具有双重抑菌效果[12，5]。柠檬酸能降低细胞间质的pH，抑制细菌生长[8]。利用酸化剂解离度存在差异，可以使用一些解离度大的酸来降低 pH，选择一些解离度小的酸来抑菌，在几种酸的协同作用下来达到抑菌的目的[5]，如苯甲酸属于解离度大的酸，可降低溶液的 pH 值，富马酸的解离度比较小，可有效协同抑菌。在此基础上，A酸中的磷酸组分高于C酸和酸无穷，磷酸可以使饲料的pH值很快下降，增强抑菌效果，所以1.1 g/mL的A酸对沙门氏菌的抑菌效果最好；酸无穷在A酸和C酸成分组成的基础上增加甲酸、乙酸和丙酸成分，挥发性有机酸通过消耗菌体ATP参与能量竞争或者抑制DNA等生物大分子合成而发挥抑菌作用[7]，通过综合几种酸的抑菌机理，抑菌效果得到增强，所以1.1 g/mL的酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好。
4 结论
A酸、C酸和酸无穷对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌均产生显著的抑菌效果，酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最优，A酸对沙门氏菌的抑菌效果最好；随着酸化剂的浓度升高，酸化剂的抑菌效果显著增强；不同浓度的酸化剂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌的体外抑菌效果差异显著；浓度为1.1 g/mL的酸无穷对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好，浓度为1.1 g/mL的A酸对沙门氏菌的效果最好。
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（作者单位：西南民族大学 生命科学与技术学院）