【摘要】 目的 探讨研究凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对胆囊癌细胞株GBC-SD生长增殖的作用及其作用途径。方法 根据处理因素将胆囊癌细胞分为：空白对照组，TSP-1组，CD36单抗阻断组、CD47单抗阻断组。用四唑盐比色法(MTT)和流式细胞术检测TSP-1及受体CD36、CD47对胆囊癌细胞生长、细胞周期的影响。结果 TSP-1组、CD36阻断组、CD47阻断组细胞生长明显低于对照组(抑制率分别为：23．63%，9．57%，18．13%)。CD36阻断组的抑制率小于CD47阻断组。TSP-1组G0/G1期细胞数增加，S期和G2/M期细胞数减少，与对照组和CD36阻断组相比有显著性差异。增殖指数分别为：对照组(39．55±2．12)、TSP-1组(26．21±0．61)、CD36阻断组(36．43±1．28)、CD47阻断组(30．73±0．38)；各组之间两两比较均有差异。结论 TSP-1可对抑制胆囊癌细胞的生长，通过与受体CD36的结合阻滞胆囊癌细胞停止于G0/G1期可能是主要的作用途径。
【关键词】胆囊癌;凝血酶敏感蛋白-1；细胞周期，生长，增殖
The influence of TSP-1 on growth of gallbladder carcinoma cell
XUE Jian-feng,FAN Zheng-jun,ZHAO Shou-kui,et al.Department of Surgery,First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China
【Abstract】 Objective To explored the role and the mechanism of TSP-1 on the growth and cell cycle of of gallbladder carcinoma cellline GBC-SD.Methods The cell line was divided into 4 groups：control group,TSP-1 group,CD36-blocked group,CD47-blocked group.To detect the role of TSP-1,CD36,CD47 on cell growth by MTT test,on cell cycle by Flow cytometry.Results The growth of GBC-SD in other group were significantly slower than in control group,inhibitory rate was respectively 23．63%，9．57%，18．13%.Inhibitory effect of growth in CD36-blocked group was lower than in CD47-blocked group.Flow cytometry indicated that the cell number in G0/G1 phase in TSP-1 group increased than that in control group and CD36-blocked group,the cell number in S and G2/M phase in TSP-1 group reduced than in control group.The proliferation index was respectively：（39．55±2．12）(control group)、（26．21±0．61）(TSP-1 group)、（36．43±1．28）(CD36-blocked group)、（30．73±0．38）(CD47-blocked group)，the difference among groups were significantly.Conclusion TSP-1 can inhibit the growth of HCCLM3 cell through combining with the receptor CD36.
【Key words】Gallbladder carcinoma；Thrombospondin-1,cell cycle；Growth;Proliferation
胆囊癌的发病率近年来有增加的趋势，发现时已多属中晚期，手术切除率低，生长快，恶性程度高[1]，胆囊癌的生长增殖是在体内各种生长因子下共同作用的结果。凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)是一多功能糖蛋白，对调节肿瘤细胞的生长、粘附、迁移等生物学行为发挥重要作用 [2]。但是TSP-1对胆囊癌的作用尚未见报道，因此研究TSP-1对胆囊癌的生长增殖影响和可能的作用机制具有重要作用。
1 材料与方法
1．1 材料 胆囊癌细胞系GBC-SD购自于中科院上海细胞所；TSP-1蛋白、CD47单抗、CD36单抗、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自于Sigma公司。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养 胆囊癌细胞系GBC-SD在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液(含双抗)，37℃含5%CO2孵箱培养，对数生长期细胞为实验对象。
1．2．2 分组 按照处理因素分为四组：实验组(加入TSP-1蛋白40 μg/ml)、空白对照组、CD36阻断组、CD47阻断组。阻断组细胞接种后先加入对应的单抗5 μg/ml，在5%CO2,37℃温箱孵育30 min,使单抗与细胞充分结合后再加入TSP-1。
1．2．3 MTT检测细胞生长 各组细胞以2×104/ml的浓度接种96孔板，每孔100 μl，孵育72 h后，吸去上清液，加入5 g/L的MTT继续培养4 h，吸去上清液，加入150 ml的DMSO震荡10 min至蓝紫色结晶完全溶解，酶标仪检测570 nm 各孔光吸收值，每组设6个复孔，计算抑制率，公式为(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值。
1．2．4 流式细胞术检测细胞周期 收获各组细胞后，70%冷乙醇固定，1 mg/ml RNase A 10 μl于37℃水浴30 min，100 μg/ml碘化丙锭(PI)50 μl,4℃避光20 min,调整细胞浓度为1×106/ml上机检测，CellQuest软件分析细胞周期。并计算增殖指数(PI)，公式为：PI=［(S+G2M)÷(G0/1+S+G2M)］×100%。
1．3 统计学方法 采用SPSS11．5行统计处理，资料用（x±s）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，α=0．05为检验水准。
2 结果
2．1 MTT法检测TSP-1对HCCLM3生长的作用结果 TSP-1组、CD36阻断组、CD47阻断组细胞生长显著低于对照组，与对照组相比抑制率分别为：23．63%、9．57%、18．13%，各组之间两两比较也有显著性差异，但CD36阻断后缓解TSP-1抑制作用的效果高于CD47阻断组。
2．2 TSP-1及受体CD36、CD47及对细胞株HCCLM3细胞周期的作用 对照组G0/G1期细胞数与CD36阻断组无显著性差异，其余各期细胞数均低于各试验组。TSP-1组G0/G1期细胞数增加，S期和G2/M期细胞数减少，显著高于对照组和CD36阻断组。CD47阻断组与TSP-1组相比G0/G1期和G2/M期细胞数无差异。CD47阻断组G0/G1期和G2/M期细胞数与CD36阻断组相比显著降低；增殖指数各组依次为：对照组(39．55±2．12)、TSP-1组(26．21±0．61)、CD36阻断组(36．43±1．28)、CD47阻断组(30．73±0．38)各组之间两两比较均有差异。
3 讨论
胆囊癌是中国较为常见的恶性肿瘤之一，易侵犯肝脏，及淋巴转移，预后极差，对放疗或着化疗敏感性差。所以研究影响胆囊癌细胞生长增殖的调控因素及其作用途径显得十分必要，并且对于阐明胆囊癌的发生、进展机制，进而寻找可能的靶向治疗的分子标志具有一定的意义。
凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)较早期发现的一种糖蛋白 [3]。最初人们研究了凝血酶敏感蛋白-1在血液系统中的作用[4]，随着研究的逐步深入，发现TSP-1可由多种肿瘤细胞合成，在乳腺肿瘤、肝脏肿瘤、甲状腺肿瘤、前列腺癌等细胞浆和细胞外基质中均有TSP-1的表达[5]，并且与这些肿瘤的发生发展有一定关系。但TSP-1与胆囊癌发生发展的关系尚未见报道，因此本实验在体外影响因素较为单一的环境下通过MTT方法检测了TSP-1对胆囊癌细胞株GBC-SD生长的作用发现：在TSP-1浓度为40 μg/ml时，作用72 h后与对照组相比生长明显受到抑制，通过功能性抗体阻断CD36、CD47与TSP-1的结合后抑制率从25．97%分别下降至10．76%和20．23%。受体CD47阻断TSP-1抑制HCCLM3生长的作用与CD36比下降较少。说明TSP-1对HCCLM3生长的抑制作用主要是通过TSP-1和其受体CD36结合的方式，作用于下游的效应分子后发挥作用的。细胞周期分析显示G0/G1期细胞显著增加，S期和G2/M期细胞数下降。TSP-1组与对照组相比使增殖指数显著下降，阻断CD36和CD47后增殖指数从27．85%分别增加至38．04%、31．78%。可见CD36阻断组可大部分缓解TSP-1对细胞周期的阻滞，CD47有少部分解除。但是阻断TSP-1和受体CD47以及CD36后并不能完全阻断TSP-1对GBC-SD的作用，说明TSP-1对GBC-SD生长的抑制和细胞周期的阻滞作用还存在其他的途径。
有文献报道TSP-1可与TGF-β1紧密结合并使其活化，含有识别TGF-β1的序列的TSP-1Ⅰ型重复片段与完整的TSP-1一样可活化TGF-β1 [6]。把包含有这种识别序列的TSP-1的重组片段注射入黑色素瘤和Lewis肺癌细胞株中可显著抑制这两种肿瘤的生长，并可诱导肿瘤细胞的凋亡。而在这一识别序列发生点突变、缺失或者不包括这种识别序列的重组片段对TGF-β1的活化作用则明显减少时[7]。说明激活TGF-β1前体是TSP-1抑制肿瘤的一个作用途径。但TSP-1对于GBC-SD生长以及细胞周期的作用是否也是通过作用于TGF-β1发挥影响尚需进一步的研究。
参考文献
［1］ 黄志强.胆道肿瘤.黄家驷外科学.人民卫生出版社,1999：1291.
［2］ Esemuede N,Lee T,Pierre-Paul D,et al.The role of thrombospondin-1 in human disease.J Surg Res.2004,122(1)：135-142.
［3］ Baenziger NL,Brodie GN,Majerus PW.A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes.Proc Natl Acad Sci.USA，1971,68：240-243.
［4］ Lawler JW,Slayter HS,Coligan JE.Isolation and characterization of a high molecular weight glycoprotein from human blood plateplets.J Biol Chem,1978,253(23)：8609.
［5］ Adams JC.Thrornbospondin-1．Int J Biochem Cell biol,1997,29：861-865.
［6］ Yevdokimova NY.Elevated level of ambient glucose stimulates the synthesis of high-molecular-weight hyaluronic acid by human mesangial cells.The involvement of transforming growth factor beta1 and its activation by thrombospondin-1．Acta Biochim Pol,2006,53(2)：383-393.
［7］ Wei-Min Miao,Wen Lin Seng,Mark Duquette,et al.Thrombospondin-1 typeⅠ repeat recombinant proteins inhibit tumor growth through transforming growth factor-bata-dependent and independent mechanisms.Cancer Reserch,2001,61：7830-7839.