云南灯盏花根腐病的2种新病原鉴定及防治药剂的室内筛选

摘要引起云南省燈盏花根腐病的病原为茄病镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和半裸镰刀菌(F.semitectum)3种真菌，茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌为灯盏花根腐病的2种新病原，其中茄病镰刀菌为主要致病菌，其分离率为42.86%，茄病镰刀菌有伤接种发病率为70%，无伤接种发病率为56.7%。采用室内生长速率法测定了50%多菌灵可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、64%恶霜·锰锌可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光假单胞杆菌可湿性粉剂5种供试杀菌剂对灯盏花根腐病主要病原茄病镰刀菌的毒力。结果表明：5种供试药剂对茄病镰刀菌都有抑制作用。对茄病镰刀菌的有效中浓度（EC50）分别为0.000 4、0.050 7、0.053 5、0.081 3和8.624 0 mg/mL，其中50%多菌灵可湿性粉剂有效中浓度最低，相对抑制效果最好。5种药剂的毒力相关系数均在0.89以上，表明药剂质量浓度与抑制作用呈较高相关性。

关键词灯盏花；根腐病；病原鉴定；毒力测定；致病性

中图分类号:S 435.67文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.028Identification of the two new pathogens of root rot disease on Erigeron

breviscapus and screening of fungicidesLai Baochun1，Hu Xianqi2，Luo Wenfu2(1. Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences of Fujian Province, Zhangzhou363005, China； 2. Key Laboratory

for Plant Pathology of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming650201, China)AbstractThe three pathogens causing root rot of Erigeron breviscapus in Yunnan Province were identified as Fusarium solani, F.oxysporum and F.semitectum, among which F. solani and F.oxysporum were two new pathogens; the main pathogen was F.solani, and the isolation frequency was 42.86%. After artificial inoculation with or without wounds, the incidence of roots infected by F.solani was 70% and 56.7%, respectively. With mycelium growth rate test method, five fungicides to F.solani had inhibition effects, indicating that the EC50 values of 50% carbendazim WP, 70% thiophanatemethyl WP, 64% oxadixyl·mancozeb WP, 10% difenoconazole WG, and 1 billion live spores of Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorescens WP were 0.000 4 mg/mL, 0.050 7 mg/mL, 0.053 5 mg/mL, 0.081 3 mg/mL and 8.624 0 mg/mL, respectively, suggesting that 50% carbendazim WP was the best. The correlation coefficients for the five fungicides were all above 0.89, indicating that mass concentration had high correlation with inhibition.

Key wordsErigeron breviscapus；root rot disease；identification of pathogen；toxicity test；pathogenicity 灯盏花［Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.Mazz.］又名短葶飞蓬、灯盏细辛，属菊科飞蓬属植物，以全草或根入药，为多年生草本。我国主要分布于西部及西南部高山和亚高山开阔山坡草地和林缘地区［1］。近年来，由于大面积的人工栽培，灯盏花根腐病的危害逐年加重，已成为限制灯盏花大面积种植的主要因素之一。目前有关灯盏花根腐病的病原已有报道［23］，由于采集地点不同及分离接种部位的差异，结果各不一样，且该病害的药剂防治也未见报道。笔者于2003-2006年对云南省灯盏花种植区进行了系统调查，对引起灯盏花根腐病的病原进行了鉴定，并选用5种杀菌剂对该病害进行了室内毒力测定，为生产上防治该病提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病原菌分离鉴定材料

通过对云南省灯盏花种植区个旧、弥勒、玉溪、泸西等地进行系统调查，观察灯盏花根腐病的田间症状特点，采集田间典型的发病标样，当天用塑料袋密封并带回实验室及时分离。

40卷第2期赖宝春等：云南灯盏花根腐病的2种新病原鉴定及防治药剂的室内筛选20141.1.2供试药剂

共5种杀菌剂：50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省新沂农药有限公司)、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(日本曹达株式会社制造)、64%恶霜·锰锌可湿性粉剂(先正达(苏州)作物保护有限公司)、10%苯醚甲环唑水分散粒剂(先正达(中国)投资有限公司)、10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光假单胞杆菌可湿性粉剂(昆明沃霖生物工程有限公司，云南农业大学植物病理重点实验室监制)。

1.2方法

1.2.1病原菌的分离和培养

选取初期发病的典型病株，在病健交界处用小剪刀将发病材料（根、茎基部）剪成4 mm×4 mm的小块，用70%乙醇和0.1%的升汞表面消毒，再经无菌水漂洗3～4次，移入PSA平面培养基，置于25 ℃恒温箱中培养。待长出菌落边缘挑取菌丝纯化培养，再做单孢分离，并初步鉴定分离物，纯化后转管保存备用。

1.2.2致病性测定

从云南师范大学购买组培苗，待组培苗长到2～3片真叶时，移栽到装有灭菌土的花盆中(d=20 cm)，保湿管理，待植株长到5片叶子以上，即可进行接种试验。用无菌水配制成2×106个/mL的孢子悬浮液备用。分别采用刺伤接菌和无伤接菌2种方法进行，用灭过菌的注射器针尖将灯盏花根、茎基部刺伤，造成一定的伤口，将已经准备好的孢子悬浮液喷洒在有伤口和无伤口的部位，对照用灭菌水。5种分离物刺伤接种和无伤接种10个处理，灭菌水刺伤接种和无伤接种2个处理，共12个处理，每处理接种30株，接种后的灯盏花移到大棚，24 h保湿，观察并记录发病情况。

1.2.3病原菌鉴定

将经致病性测定后重新获得的分离物分别置于PSA培养基上，25 ℃下培养，不能产生大孢子的可以在综合培养基和VBC培养基［4］上再培养。4 d后测量菌落生长速率，观察培养性状，15 d后觀察形态特征，并进行显微观测和照相记录，20 d后观察厚垣孢子形态及色素的颜色。根据文献［47］进行鉴定。

1.2.4杀菌剂室内毒力筛选

采用生长速率法［8］测定药剂的抑菌作用。在无菌条件下，将供试的5种药剂用灭菌水分别配成5个所需体积质量浓度，分别取200 μL的药剂溶液加入10 mL PDA培养基中摊平。将扩大培养8 d的病原菌打成直径为0.4 cm的菌饼，将菌饼移入带毒培养基中培养。设加灭菌水的PDA培养基为空白对照。5种药剂和空白对照共31个处理，每个处理设3次重复。置于25 ℃恒温箱中培养，4 d后观察抑菌情况。用十字交叉法测量菌落直径，计算生长抑制率。

生长抑制率(%)=［(对照菌落直径—处理菌落直径)/对照菌落直径］×100；

将抑制生长百分率换算成几率值，浓度换算成浓度对数。以浓度对数为自变量x,以几率值为变量y，建立毒力回归方程y=a+bx, 毒力回归方程能有效地反映该药剂浓度与抑菌效果的关系，从毒力回归方程求出每个药剂的抑制中浓度EC50。

2结果与分析

2.1症状描述

灯盏花根腐病在整个生育期均会发病，密植、氮肥施用过多、高湿的田块发病严重，病菌沿行传播蔓延，田间发病率一般为10%～15%，严重的超过30%。受病原菌危害的灯盏花地上部与健康植株相比较为矮小，长势弱，中下部叶片黄化，萎蔫，花少，茎基部变黑腐烂，发病初期先由须根、支根变褐腐烂，最后全根腐烂，地上部自茎尖向下枯萎至全株枯死(图1)。

2.2分离物的分离频率

在PSA培养基上分离纯化得到5种真菌，它们分别为茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、链格孢、厚孢轮枝菌。其中茄病镰刀菌和链格孢分离频率较高，分别为42.86%和28.57%，其次是尖孢镰刀菌，分离频率为17.86%，半裸镰刀菌和厚孢轮枝菌分离频率为7.10%和3.57%。

2.3致病性测定结果

结果表明，除了茄病镰刀菌(Fusarium solani)孢镰刀菌(F.oxysporum)和半裸镰刀菌(F.semitectum)具有致病性外,其他真菌分离物均不能引起灯盏花发病。各菌株侵染致病的潜伏期较短，接种8 d后开始显症，15 d后达到发病的高峰期。三种镰刀菌中茄病镰刀菌致病性最强，刺伤接种发病率为70.0%，无伤接种发病率为56.7%；尖孢镰刀菌刺伤接种发病率为30.0%，无伤接种发病率为16.7%；半裸镰刀菌刺伤接种发病率最低为20.0%，无伤接种发病率为10.0%。症状表现和田间发病植株相一致，对照不发病。从接种发病的组织中重新分离的病原菌，与接种的病原菌完全一致。图1灯盏花根腐病田间症状

Fig.1Symptoms of Erigeron breviscapus root rot in field

表15种病原菌对灯盏花根部的致病性测定

Table 1Pathogenicity test of five pathogens causing the root rot of Erigeron breviscapus供试菌种

Test strain接种方式

Inoculation method接种数量/株

Inoculated plants发病数量/株

Infected plants发病率/%

Incidence茄病镰刀菌 F.solani刺伤接种 Wound inoculation302170.0无伤接种 Unwounded inoculation301756.7尖孢镰刀菌 F.oxysporum 刺伤接种 Wound inoculation30930.0无伤接种 Unwounded inoculation30516.7半裸镰刀菌 F.semitectum刺伤接种 Wound inoculation30620.0无伤接种 Unwounded inoculation30310.0链格孢 Alternaria tenuis刺伤接种 Wound inoculation3000.0无伤接种 Unwounded inoculation3000.0厚孢轮枝菌

Verticillium chlamydosporium刺伤接种 Wound inoculation3000.0无伤接种 Unwounded inoculation3000.0对照CK刺伤接种 Wound inoculation3000.0无伤接种 Unwounded inoculation3000.0

2.4致病菌的培养性状及孢子形态特征

茄病镰刀菌：在PSA培养基上，25 ℃条件下4 d后菌落直径为4.4 cm，气生菌丝棉絮状，呈苍白色至浅灰色，间有土黄色的分生孢子座，基物表层肉色，培养基不变色。显微镜下观察，小型分生孢子数量多，卵形、肾形，假头状着生，大小为(10～21.5)μm×(3.0～4.5)μm。大型分生孢子生于气生菌丝、分生孢子梗座和黏孢团中，椭圆形弯曲，顶端细胞短、圆钝，有时喙状，基端细胞圆钝，大小为(25.0～395)μm×(3.9～6.5)μm。厚垣孢子多，卵形，在菌丝或孢子顶端或中间单生、间生，直径(6.2～9.8)μm。产孢细胞单瓶梗，在气生菌丝上为长筒形，在分生孢子座上成簇产生，多分枝，长短不一，大小为(31.2～101.4)μm×(2.6～3.4)μm（图2 a，b）。

尖孢镰刀菌：PSA培养基上25 ℃下培养4 d后菌落直径为5.5 cm，气生菌丝羊毛状，白至粉白色，基物本身无色。小型分生孢子数量多，肾形，假头状着生在产孢细胞上，大小为(6.0～12.5)μm×(2.5～3.2)μm。大型分生孢子镰刀状，稍弯，多数3个隔，大小为(15.0～32.6)μm×(3.5～4.0)μm。容易产生厚垣孢子，球形，单生、对生或串生，直径为(6.5～8.0)μm。产孢细胞单瓶梗，较短（图2 c，d）。

半裸镰刀菌：PSA培养基上25 ℃下培养4 d后菌落直径为5.8 cm，气生菌丝棉絮状，白至浅驼色，基物不变色。大型分生孢子生于气生菌丝中，多数3～5个隔，分生孢子披针形、纺锤形至镰形，具楔形脚孢及弯曲的顶端细胞，大小：(11.0～40.2)μm×(2.6～4.5)μm。厚垣孢子球形，直径(5.5～10.0)μm。产孢细胞为多芽生（图2 e，f）。

2.5防治药剂的筛选

用生长速率法测定结果（表2）表明，50%多菌灵可湿性粉剂对菌丝生长抑制效果最好，在药剂质量浓度为0.002 5～0.01 mg/mL多菌灵的PDA培养基上接种4 d后，菌丝生长的平均抑制率均为85%以上。70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂对菌丝生长抑制效果较好，在药剂质量浓度为0.3～0.7 mg/mL甲基硫菌灵的PDA培养基上接种4 d后，菌丝生长的平均抑制率均为74.93%～80.0%。在药剂质量浓度为0.15～0.6 mg/mL苯醚甲环唑的PDA培养基上接种4 d后，菌丝生长的平均抑制率均为56.72%～81.79%。64%恶霜灵锰锌可湿性粉剂抑菌效果次之，10亿活芽孢/g 枯草芽孢杆菌·荧光假单胞杆菌可湿性粉剂抑菌效果最差，在药剂质量浓度为2～4 mg/mL，平均抑制率为30.75%～40.90%。图2灯盏花根腐病病原菌的微观形态特征

Fig.2Microscopic morphological characters of the

pathogens from root rot of Erigeron breviscapus

表2五种药剂不同浓度对灯盏花根腐病菌的抑制作用

Table 2Inhibitory effects on five fungicides at different concentrations on root rot of Erigeron breviscapus药剂

Fungicide质量浓度/mg·mL-1

Mass concentration菌落平均直径/cm

Colony average diameter平均抑制率/%

Average inhibition ratio10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光

假单胞杆菌WP

1 billion live spore/g Bacillus subtilis and

Pseudomonas fluorescens WP4.01.9840.903.02.2532.842.02.3230.751.52.4526.871.02.5523.8870%甲基硫菌灵WP

70% Thiophanatemethyl WP0.6780.000.700.350.7378.210.300.8474.930.151.0768.060.101.1067.1650%多菌灵WP

50% Carbendazim WP0.010 00100.000.005 00.294.030.002 50.585.070.001 00.876.120.000 51.361.1910%苯醚甲环唑WG

10% Difenoconazole WG0.600.6181.790.301.1166.870.151.4556.720.101.6251.640.051.9541.7964%恶霜·锰锌WP

64% Oxadixyl·mancozeb WP0.2000.8375.220.1500.9073.130.1001.0967.460.0501.9541.790.0252.0837.91对照CK-3.35-2.6五种药剂的毒力及EC50

室内毒力测定结果（表3）表明：10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光假单胞杆菌可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、50%多菌灵可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、64%恶霜·锰锌可湿性粉剂的有效中浓度(EC50)分别为8624 0、0.050 7、0.000 4、0.081 3 mg/mL和0.053 5 mg/mL，其中50%多菌灵可湿性粉剂有效中浓度最低，相对抑制效果最好；70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、64%恶霜·锰锌可湿性粉剂次之；10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光假单胞杆菌可湿性粉剂最差。5种药剂的相关系数均在0.89以上，表明药剂浓度与抑制作用呈现较高的相关性。

表3五种药剂对灯盏花根腐病菌的毒力回归方程与EC50

Table 3The toxicity equation and EC50 of the five fungicides against the pathogen of root rot of Erigeron breviscapus

药剂 Fungicide毒力回归方程(y=)

Toxicity regression equationEC50 /mg·mL-1R10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光假单胞杆菌WP

1 billion live spore/g Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorescensWP4.240 3+0.811 9x 8.624 00.981 470%甲基硫菌灵 WP 70% Thiophanatemethyl WP6.042 7+0.805 2x 0.050 70.965 550%多菌灵WP 50% Carbendazim WP13.711 0+2.571 9x0.000 40.890 710%苯醚甲环唑WG 10% Difenoconazole WG5.977 2+0.896 8x0.081 30.983 264%惡霜·锰锌WP 64% Oxadixyl·mancozeb WP6.618 3+1.272 8x0.053 50.986 8

3讨论与结论

3.1病原菌的分离和鉴定

目前为止，有关引起云南省灯盏花根腐病的病原菌说法各不一样，杜宾等［2］报道，引起云南省昆明市灯盏花根腐病的病原菌为拟枝孢镰刀菌(F.sporotrichioides)，分离部位为根部，分离物经单孢分离后，接种方式为刺伤根部灌根接种；林丽飞等［3］报道云南省栽培区灯盏花根腐病的病原菌为半裸镰孢(F.semitectum)和胶孢镰孢(F.subglutinans)，分离部位为根部，分离物没有经过单孢分离，纯化后以刺伤根部接种。不同地区灯盏花根腐病病原菌不同的原因，一是采样调查的地域及环境条件不同，引起灯盏花发生根腐病的病原菌可能存在差异；二是分离部位不同，病原菌主要侵染灯盏花的根部和茎基部。笔者采样调查的地市与林丽飞相同，但采集基地不同；本试验从灯盏花的根部和茎基部进行分离，分离物经过单孢分离，以有伤接种和无伤接种2种方式于灯盏花根部和茎基部进行接种；本试验通过对云南省灯盏花主栽培区灯盏花根腐病的田间调查、采样、分离、鉴定、致病性测定及再分离的结果表明，茄病镰刀菌（F.solani）、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和半裸镰刀菌(F.semitectum)为引起灯盏花根腐病的病原菌，其中茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌是引起灯盏花根部病害的2种新病原。

镰刀菌可引起多种药用植物的根腐病，很多文献报道由尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、半裸镰刀菌引起药用植物巴戟天、三七、竹节人参、高山红景天、麻黄、黄芪、白术等的根腐病已成为药用植物生产的主要障碍［911］。有研究表明药用植物的根腐病与地下线虫、根螨的危害有关，在土壤黏重，田间积水过多时发病严重［12］。本课题组调查的多种寄生线虫［1315］引起的灯盏花线虫病，笔者认为这些寄生线虫的危害造成伤口可能为根腐病菌的侵入创造了有利的条件。张绍升［16］认为寄生线虫与病原微生物的共同侵染导致植物病害所造成的损失远远大于两种病原物单独危害的结果。因此，灯盏花寄生线虫与根腐病菌的复合侵染接种有待进一步深入研究。

3.2药剂防治研究

在灯盏花根腐病的药剂防治方面，目前国内还没有关于药剂对灯盏花根腐病菌毒力测定的相关报道。本试验根据药剂的特性及灯盏花不同生育期、不同季节筛选了5种对灯盏花根腐病菌有一定抑制效果的杀菌剂并对其室内抑菌毒力进行了测定。选用的5种杀菌剂均为广谱、高效、低毒的药剂，其中10亿活芽胞/g 枯草芽胞杆菌·荧光假单胞杆菌可湿性粉剂为生物杀菌剂，说明书上介绍该药剂对镰刀菌引起的植物根腐病有显著的防治效果。室内对灯盏花根腐病菌分生孢子萌发抑制率为99.32%，但对菌丝的抑制效果较差，可作为灯盏花苗期或发病前期的预防使用。50%多菌灵可湿性粉剂和10%苯醚甲环

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