摘要: 【目的】为了验证COI1基因在葡萄抗病防御机制中的作用，【方法】在前期通过抑制消减杂交技术（SSH）获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ COI1基因EST序列的基础上，采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到COI1基因cDNA序列， 并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了COI1基因的表达特异性，以期验证其在葡萄抗病防御机制中的作用。【结果】序列分析表明，VqCOI1基因长2 455 bp，编码598个氨基酸残基，相对分子量为67.87 ku，等电点为5.85。同源性分析表明，它与已克隆的大豆（Glycine max）COI1基因（GenBank登录号: AAZ66745.1）相似性最高为79%。实时定量PCR技术用来检测VqCOI1基因在受到病原菌侵染和激素处理时在抗病品种‘商－24’中的表达情况，结果表明，在白粉菌诱导初期，抗病的毛葡萄株系‘商-24’ VqCOI1基因表达量升高，这可能是因为它参与了病原菌诱导的JA信号调节途径。水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（Eth）处理表明VqCOI1基因表达受激素分子调节，这些信号分子可能交叉调节这一基因的表达。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqCOI1基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqCOI1的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控，很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。
关键词: 中国野生葡萄； VqCOI1基因； 克隆； 表达分析
中图分类号：Ｓ６６3．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－990－０7
植物在自然条件下，长期的生长发育过程中常常受到周围环境中各种因子的刺激，例如干旱、水淹、高盐、低温、病毒、细菌和真菌等， 当植物受到病原菌侵染时，随着植物与病原菌的长期互作，协同作用，已经进化出了许多防御抗性机制来抵抗病原微生物的侵袭。这种防御机制包括植物自身的一些生理作用或化学障碍物以及病原物侵染植物后诱导植物一系列防卫反应的发生。许多植物的代谢过程都是受到多种酶的合成与降解的平衡作用调控的，其中，植物通过泛素化途径对许多蛋白的降解过程在植物的抗病反应中起着重要作用。许多研究表明，E3泛素连接酶和相关蛋白的降解在植物信号转导途径中起着重要作用，并最终导致植物抗病性的发生[1-2]。
病虫害的侵染会刺激植物体内的合成JA和Eth，启动植物内源信号分子的调节，进而激活一些病程相关蛋白的表达，各种途径相互交叉，使得植物形成对病原菌的应激反应。研究表明，JA信号途径在植物抗性调节中起着重要作用[3]。COI1基因是是目前所发现的拟南芥茉莉酸信号传导途径中最重要的调控基因。它与植物的育性和抗性两类完全不同的性状有关。COI1蛋白包含有一个F-BOX结构域和不完整的富含亮氨酸重复结构域（LRR），它是一个新的F-BOX蛋白[4]。它可以与ASK1/ASK2、CUL1和RBX1结合，形成SCFCOI1 E3连接酶复合体[5]，这个SCFCOI1 E3复合物可以特异识别茉莉素信号转导途径的一些调控因子，使其泛素化而由26s蛋白体降解，从而开启下游基因的表达和下游茉莉素信号传导，调控植物的生长发育和抗逆性。在拟南芥coil1突变体发现后的十年中，一直没有找到 SCFCOI1的靶蛋白。直到 2007年，3个课题组分别利用不同的方法同时发现了拟南芥中茉莉酸信号途径的重要调控因子-JAZ蛋白[6]。Thines 等[6]利用了JAZ1-GUS融合蛋白证明了JAZ蛋白为SCFCOI1的底物。Yan等[7]采用生物芯片技术进一步证明了这种蛋白质是茉莉酸响应基因的负调控因子。由于它特有的jas保守结构域，它可以通过COI1介导的植物泛素化途径调节植物早期抗性反应和诱导植物抗病性。目前，COI1在葡萄等单子叶植物中的分子机制尚不清楚。由于葡萄白粉病[Uncinula necator （Schw.） Burr]在世界范围内的严重危害性，为了深入了解葡萄抗白粉病分子机理，项目组在前期构建了接种与未接种白粉菌的高抗白粉病的中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ SSH文库，获得了COI1基因的EST序列（GenBank number: JK266496）。我们就是在此基础上，采用RT-PCR技术克隆了中国野生葡萄COI1基因，并进行表达分析，为进一步深入了解COI1 基因的生物学功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 葡萄材料与处理
采集毛葡萄‘商-24’嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须不同组织，迅速置于液氮罐带回实验室-80 ℃冻存。
1.2 总RNA提取与cDNA第1链合成
葡萄叶片总RNA的提取参照张今今等[8]改进的SDS酚法， 葡萄叶片总RNA的纯化参照王西平[9]的方法进行。取RNA 1 μL（浓度为1 g·L-1），1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。其中，用于RT-PCR和Real-time PCR技术的第1链cDNA的合成按照TaKaRa公司反转录试剂盒进行。
1.3 中国野生毛葡萄COI1基因克隆
1.4 VqCOI1基因序列分析
将获得的序列用Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）程序在NCBI网站通过同源性比对验证基因的完整性。用ProtParam程序预测克隆得到基因所编码产物的蛋白质一级结构、分子量和等电点。利用CLUSTALW（http: //align. genome. jp/clustalw/）在线分析软件对不同物种的COI1基因进行进化树分析。
1.5 VqCOI1基因表达分析
2 结果与分析
2.1 中国野生毛葡萄VqCOI1基因的克隆及序列分析
3 讨 论
在本课题组前期构建的白粉菌诱导下的中国野生华东葡萄‘商-24’ cDNA 文库中筛选获得的与衰老相关蛋白基因相关的 EST 序列的基础上，克隆了VqCOI1基因。VqCOI1 基因在不同组织中的转录表达分析说明该基因的表达具有空间差异性。病原菌诱导后的实时定量结果表明，COI1基因参与了植物早期的抗病反应，通过病原菌的侵染，启动植物体内源激素分子的调控途径，参与泛素化途径的降解作用，激活病程相关蛋白基因的表达。外源施加水杨酸、茉莉酸、乙烯这3种激素时，COI1基因也诱导表达，MeJA处理下，COI1参与了JA 信号转导途径，通过选择性地结合JA 应答反应的抑制因子，介导该抑制因子与泛素结合，然后通过泛素介导的蛋白质水解途径使该抑制因子失活，由此开启JA 信号转导途径，使植物产生 JA 应答反应。
乙烯作为一种重要的气态激素分子，也参与了植物对病原菌等生物胁迫的应激反应[10]。ERF是乙烯调控途径中重要的转录因子，它可以参与植物防卫反应的发生，除了乙烯，ERF也参与了茉莉酸和水杨酸介导的信号途径，从而调控植物下游抗病基因的表达。有研究明确指出，乙烯参与了许多防卫反应基因的表达，其中包括一些PR蛋白如几丁质酶，PR-1，防卫素和植物抗毒素合成酶等[11]。定量结果表明，乙烯处理可以诱导COI1基因的表达，由于JA/ET信号途径与SA信号途径之间存着显著的交叉，乙烯处理后如何参与COI1基因的表达仍需进一步研究。
SA介导的植物信号途径参与到“基因对基因”假说[12]的抗性反应中，植物体内内源水杨酸信号分子的积累会诱导多种病程相关蛋白的表达，诱发植物获得系统抗性。研究表明，当病原菌侵染烟草，黄瓜和拟南芥时，被侵染植物叶片内的水杨酸含量迅速上升，最终诱发植物系统获得性抗性的发生[13-14]。此外，外源施加SA也能使诱导植物系统获得抗性反应的发生，从而使植物抵抗病原菌的侵入。SA刺激后COI1基因的表达明显升高，这可能是由于水杨酸能够通过专一地抑制过氧化氢酶活性来增加植物体内H2O2的含量，进而导致一些与SAR有关的防卫反应基因的表达，最终使植物获得抗病性[15-17]。
目前JA 信号转导途径在单子叶植物中的研究很少，VqCOI1 基因的获得为研究葡萄中JA应答反应机制提供了很好的基础。这对于揭示葡萄抗逆机理，寻找有效的途径来提高葡萄抗病性有着非常重要的意义。
4 结 论
对VqCOI1基因在受到病原菌侵染和不同信号分子刺激时的表达研究初步证明了该基因响应葡萄白粉病病原菌的侵染并受生物胁迫不同激素的调节作用，而这些激素均是病原菌响应的信号分子，推测VqCOI1基因可能参与植物的抗病调节过程，将VqCOI1基因的表达与葡萄白粉病的抗病机制相结合将为后续葡萄抗白粉病的转基因育种奠定基础。
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