通讯作者：辛英才 组织因子相关微粒（tissue factor-bearing microparticles， TF-MPs）在许多疾病的血栓形成过程中发挥着重要功能。目前已知，TF-MPs具有促进凝血与血栓形成等多种生物学活性，可介导很多疾病的凝血机制紊乱，研究TF-MPs的功能有助于深化对凝血机制障碍的认识，并为凝血功能障碍调控提供潜在的干预目标[1]。
通过对大鼠血栓模型中组织因子相关微粒的数目变化及阳性表达情况的分析，探索组织因子相关微粒对凝血级联反应的影响关系，为血栓患者的早期预防和治疗血栓、预测预后提供新的思路。现在就TF-MPs与大鼠血栓模型的影响分析予以综述。
1 组织因子相关微粒（TF-MPs）
1.1 TF-MPs的来源 微粒（microparticles MPs）是细胞膜重塑后从受刺激细胞或凋亡细胞中释放出的片段。在细胞受到刺激或者是细胞在凋亡时，细胞膜的不对称性遭到破坏，使细胞膜外层的磷脂酰丝氨酸暴露，这些磷脂酰丝氨酸带负电荷，进而细胞骨架及蛋白构架发生该变，最终，小囊泡从细胞膜脱落形成MPS[2]。通常MPS指的就是位于0.1～1 μm的细胞膜碎片暴露出的磷脂酰丝氨酸。在微粒的表面， 出现了血栓调节蛋白、组织因子途径物、或蛋白质C可能提示着微粒MP指导的抗凝血途径开始。然而，脂多糖治疗会促进组织因子的表达，在组织因子和促凝血酶原激酶的刺激下，位于单核细胞和衍生的微粒MP表面的血栓调节蛋白的活性是极强的[3，4]。有大量研究显示，当单核细胞、内皮细胞、血小板等受到刺激时，能表达释放出含有组织因子的微粒，这些微粒有明确的TF相关促凝血活性。当血液中表达循环TF的微粒水平升高时，血液也表现出高凝状态，由此可以推断，通过检测大鼠血栓模型中的循环TF微粒水平，研究其血栓形成的特点，可为血栓患者的早期预防和治疗血栓、预测预后提供新的思路。
1.2 TF-MPs的定义 当MPs从细胞膜上脱落后，在受到脂多糖刺激后，单核细胞和衍生的微粒MP表面的血栓调节蛋白的活性是极强的，这些单核细胞脱落出的高表达TF的MPs[5]。这类高表达TF的MPs，称为TF-MPs。
1.3 TF-MP的生物学效应 在血管内皮损伤后，会刺激凝血级联反应的放大效应，组织因子在止血和血栓形成中起到加速放大的作用。在血浆中，组织因子以多种形式存在，其中就包括微粒和交替拼接而成的组织因子，而以微粒形式存在的就是组织因子相关微粒TF-MPs。当细胞受到刺激或者是凋亡时，TF-MPs大量释放入血，推测就是TF-MPs促进了凝血级联反应的发展。
在一些凝血功能障碍相关疾病中，TF-MPs在血浆中的数目及表达提高，例如败血症、动脉粥样硬化、镰刀形细胞贫血和癌症。一份研究显示，通过提取心脏外科患者的心包积液中的TF-MPs，将其注入大鼠模型中而促进了大鼠静脉血栓的形成。在健康大鼠体内，造血细胞衍生的TF-MPs可增加大鼠提睾肌微循环的血栓形成。在肿瘤大鼠模型中，组织因子抗原与肿瘤大小密切相关，增高的肿瘤衍生的微粒水平与升高的凝血-抗凝血混合物水平密切相关。这些研究强有力地证实了TF-MPs在许多疾病中促进了血栓的形成。
活化的TF-MPs为凝血级联系统中的独特酶复合体提供了一个额外的促凝血磷脂表面。他们的催化性是依靠促凝血的负离子氨基磷脂、磷脂酰丝氨酸，在细胞膜重构后异位到血浆外的小叶。在实验研究中发现，TF存在于正常血管的血液循环中，因此，有学者推测TF-MPs调控着凝血的级联反应，在未受刺激时，TF-MPs处于休眠状态，从而不会产生血栓，而且其浓度很低，不会对抗组织因子途径抑制物；而受到刺激时（如血管受损），大量的TF-MPs高表达于血循环中，参与凝血的激活[6]。
2 血栓模型
2.1 血栓模型动物的选择 血栓动物模型是研究血栓发病机制及凝血级联反应的基本实验条件。在文献报道中，约有8种动物用来制备血栓模型，而最常见的是用大鼠、兔、犬、猪来制备血栓动物模型。对于研究血栓动物中TF-MPs的变化，采用大鼠作为模型动物最佳，因为大鼠血栓模型最为经济、常用，也适用于对干扰因素对抗血栓机制的研究。兔模血栓模型多用于研究血栓后的静脉壁组织和细胞的病理学改变；犬模血栓模型常用于血管介入溶栓及区栓的相关研究；猪模血栓模型多用于观察血管壁的组织学变化，造价最为昂贵。所以，对于研究TF-MPs在血栓动物模型中的变化及相关影响因素，最宜选择大鼠作为造模对象。[7]
2.2 血栓动物模型的制备 目前，建立静脉血栓动物模型的方法有如下几种方法：①机械性损伤法。②电流损伤法。③结扎法。④光化学法。⑤创伤性肢体深静脉血栓形成法。⑥化学药物致血栓形成法。目前在研究TF-MPs中大鼠血栓模型的制备中，多采用化学药物致血栓形成法，也有Falati[8]用光化学法制备模型，他用激光损伤大鼠的提睾肌动脉制备模型，激光刺激内皮细胞产生的TF最少，可避免内皮下暴露的TF干扰，但是血栓模型的成功率较化学药物法低。
用化学药物法制备血栓模型，最常用的是角叉菜胶（Ca）在大鼠皮下注射角叉菜胶后，多数大鼠尾尖部于3～14 h会出现暗红色血栓区，逐渐向尾根部扩大，48～72 h会发绀变为黑色，而后变干变细，最终脱落。如果对角叉菜胶诱导的大鼠血栓模型成功率不满意，还可以采用联合应用角叉菜胶Ca与细菌内毒素（LPS）建造大鼠血栓模型。在大鼠腹腔注射Ca，16 h后再静脉注射LPS，经试验证明，造模后的大鼠尾部均形成了稳定的血栓[9]。通过在建模后观察尾部血栓不同时间的情况，测定外周血中的化验指标，可以得出血栓与凝血指标的相互变化。
在以往的败血症动物模型中，组织因子的表达促进了血管内的凝血及扩散。在循环血液当中，单核细胞是组织因子的主要来源。事实上，在人类毒血症患者中，磷酯酰丝氨酸（LPS）刺激单核细胞诱导组织因子mRNA和蛋白质表达在人类毒素血症模型中。另外，我们已经知道在造血细胞中降低组织因子的表达与在内毒素血症的大鼠模型中降低凝血-抗凝血物水平密切相关。因此，用内毒素构建的大鼠血栓模型，更有益于研究TF-MPs在大鼠血液中变化情况。
3 TF-MPs的检测
3.1 TF-MPs的检测方式 血浆的组织因子水平可用多种方式检测，其中包括酶联免疫吸附实验（ELISA），流式细胞学计数，阻抗实验和激活实验。组织因子水平已经在健康人体中发现，这些研究结果的发现是由于用了不同的抗组织因子抗体和高水平的研究仪器，酶联免疫吸附实验可以检测组织因子的水平，能被用于测量因子十（FXa）在血浆中产生。然而，最近的研究发现这项实验不能测量血浆中激活的组织因子，因为观察到FXa的产生不能被活性部位灭活的FV11a所抑制。用一种二者择一的方法分离血浆中的微粒，并且测量它们的促凝活性。用一种称作1B10的特异抗体捕获的微粒收集这种微粒。或是用超速离心的方法分离这种微粒。在这些研究中，抑制性抗人类组织因子抗体存在与否的情况下，通过两步发色激活分析法测量促凝活性。
3.2 TF-MPs的提取 在大鼠（2～3月大）腹膜腔内注射细菌内毒素（LPS）（7.5 mg/Kg）和角叉菜胶Ca后制备血栓大鼠模型。在药物注射6 h后，从静脉腔内抽取全血并注入0.38%的柠檬酸钠。大鼠血浆以4000转超速离心15 min，两步法离心分离乏血小板血浆（PFP），此血浆平均分为50微升后，在-80摄氏度下冷冻。
3.3 TF-MPs的检测 提取好的乏血小板血浆（PFP），20℃ 下离心l5 min获取微粒碎片，弃去225 μl上清液，加入225 μl缓冲液（NaCl 140 mmol/L，KCl4.5 mmol/L，MgCl2 1 mmo1/L，CaCl22.5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH7.4，0.2 m滤膜过滤），再次离心；弃去225 μl上清液，加75 μl缓冲液，重悬。将100 μl富含微粒的悬液按每份标本5 μl进行检测，加35 μl缓冲液和5 μl牛血清白蛋白（BSA）稀释，室温孵育15 min。然后加入2O0 μl缓冲液再次离心。弃去200 μl上清液，加入200 μl缓冲液和100 μl计数微球，重悬，再次制成微粒悬液。然后用流式细胞仪进行计数分析，得到数据。根据侧向光散射（Ssc）和前向光散射（Fsc）散点图设定标准检测微球门，应用7.2 μm和1.0 μm 的微球当做内参照的检测微粒，把1.O μm微粒用来设门，7.2 μm乳胶微球用来定量，以结合Annexin V和结合TF的抗体定量来定义表达TF 的微粒。
4 TF-MPs与大鼠血栓模型对血栓疾病研究的展望
4.1 组织因子相关微粒在复杂的血栓形成中起着作用，并且与多种疾病有关，其中包括败血症和癌症。大鼠作为一个最普通的动物实验用于活的机体实验。从以往的研究中，我们看到组织因子阳性微粒和内毒素血症大鼠模型凝血-抗凝血物间有线性回归关系，以前的研究结果显示出人类组织因子抗原水平有相同的相关性。这些研究数据强有力的指出在内毒素血症和癌症大鼠模型中组织因子阳性微粒激活了促凝作用。
4.2 在以往的研究中，选择素类和TF-MPs的促血栓作用是紧密联系的。在内皮细胞损伤后，大量TF-MPs和白细胞团进入血栓中，这个过程P选择蛋白（由血小板或内皮细胞表层挤出的一种粘附分子）是必须存在的。血小板选凝素糖蛋白配体1（PSGL-1）和血小板P选择蛋白的相互作用被证明是在血栓边缘的TF活性集聚的必要因素。在白细胞性血栓相互作用之前，造血细胞衍生的TF蓄积在形成血栓时与MPS积聚的动力学相关联。在A型血友病的大鼠模型中，可溶性的P选择蛋白被证明是促进白细胞衍生的TF-MPs脱落，它很可能来自于单核细胞。MPS的血浆水平随着年龄的增长而增长，但在PSGL-1老鼠模型中是例外的，这说明了PSGL-1途径的作用。此外，在设计大鼠模型中，达到了几倍高度的血浆P选择蛋白浓度，从而证明了不寻常的促凝血能力和突出的循环性白细胞衍生MPS包含的TF。P-选择蛋白所引发的其他机制可能有助于增加血栓形成倾向。经证明，P-选择蛋白趋向于转移到来自单核细胞衍生的MPs分类的TF，或者是运输到一个功能性的血小板实体。 P选择蛋白同样会促进由单核细胞和TF表达的磷脂酰丝氨酸暴露[10]。
4.3 TF-MPs通过P选择蛋白交互作用的补充作用，可能通过诱导纤维蛋白形成稳定的血栓。因为PSGL-1的相互作用通常能调停不稳定的转换，附加的细胞黏合素能够促进血栓的稳定作用。在缺血淤滞的血管中，TF-MPs在血栓形成过程中起着决定性作用。淤滞会局限吸收来的MPS，在设计的大鼠模型中表现出高水平的白细胞衍生的MPS，并且将其提呈给缺血部位。P选择蛋白在内皮细胞促成MPS募集增强反应中起正调节作用，这导致在深静脉中可看到的大量血栓。静脉血栓栓塞疾病的患者中，内皮细胞，血小板和白细胞明显的活动性可能证明通过检测TF-MPs、P选择蛋白的表达和血小板白细胞的集聚是有意义的[11]。
5 总结
近年来，越来越多的研究着重于TF-MPs 在心血管疾病、肿瘤、炎症及血栓类等疾病中的临床应用，结果发现TF-MPs 水平增高及MPs 相关TF 活性增高对血栓形成及疾病的进展密切相关。目前，通过对大鼠血栓模型进行干预，研究其血浆中的组织因子数量及活性变化与大鼠血栓情况的关系，可以为血栓类疾病的发展及预后提供参考，可为血栓患者的治疗提供新的思路。
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