摘要：【目的】克隆猪EIF2S3基因mRNA全长，并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征，为研究真核翻译起始因子2（eIF2）蛋白γ亚基的生物学功能打下基础。【方法】以荣昌猪胸腺mRNA为模板，采用RCAE-PCR克隆EIF2S3基因的mRNA全长序列，在线完成各种生物信息学分析后，利用实时荧光定量PCR分析猪EIF2S3基因的组织表达特征。【结果】猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp，其中蛋白质编码区（CDS）长1419 bp，5" UTR区、3" UTR区分别长14和380 bp，编码472个氨基酸。EIF2S3蛋白分子量51.1 kD，理论等电点（pI）8.62，包含58个带正电的氨基酸和52个带负电的氨基酸，其前体蛋白靠近N端区域有一个强疏水区；EIF2S3蛋白的空间结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成。EIF2S3蛋白氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高（99.6%），其次是马、猫、牛、羊和人类（99.4%），与斑马鱼的相似性最低（96.6%）。EIF2S3基因在猪的心脏、胸腺和淋巴组织中表达量较高，在脾脏和肌肉中呈中度表达，在肾脏中的表达量较低，而在肝脏中基本不表达。【结论】猪EIF2S3基因全长1813 bp，在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源，尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近；其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高，在肝脏中基本不表达，据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能，基本不发挥能量代谢功能。
关键词： 猪；真核翻译起始因子2（eIF2）；EIF2S3基因；克隆；序列分析；组织表达谱
中图分类号： S828.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）10-2062-08
0 引言
【研究意义】动物机体可通过调节蛋白合成来调控基因的快速、可逆及空间表达，其中翻译起始既是蛋白合成的第一步，也是限制蛋白合成的关键步骤（Jackson et al.，2010）。真核翻译起始因子2（Eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）可与GTP和tRNAiMet相互结合形成三元复合物，而三元复合物先与核糖体40S结合形成翻译起始前复合物，再与mRNA的5"末端结合并搜寻mRNA的翻译起始位点（通常为AUG密码子）（Yatime et al.，2007），继而启动后续的翻译过程。因此，研究eIF2的生物学功能对揭示真核生物蛋白合成机理具有重要意义。【前人研究进展】eIF2由3个高度保守的亚基（α、β和γ）序列组成。其中，α亚基是eIF2的调节亚基，即eIF2上游的各磷酸化激酶通过α亚基上的第51位丝氨酸磷酸化位点调节eIF2蛋白活性；β亚基的主要功能是与eIF2下游蛋白eIF5和eIF2B及RNA结合，启动蛋白合成（Kimball and Jefferson，2004）；γ亚基是eIF2的核心亚基（Yatime et al.，2007），具有结合GTP及tRNA的能力，还能结合Zn2+的锌指结合基序（Ito et al.，2004；Rollmecak et al.，2004；Hinnebusch，2005）。eIF2蛋白γ亚基含有472个氨基酸，由EIF2S3基因编码，其分子量约51.0 kD。已有研究表明，EIF2S3基因变异及其表达量变化与多种疾病相关。如EIF2S3蛋白第465位亮氨酸向絲氨酸的移码突变及第108位丝氨酸向精氨酸的错义突变，会引起临床表现为精神发育迟滞、癫痫、性腺机能减退/先天性不育、小头和肥胖的MEHMO症（Moortgat et al.，2016；Michaud，2017；Skopkova et al.，2017；Stanik et al.，2018）；EIF2S3基因可能是通过N-myc下游的调节基因1间接抑制前列腺癌转移（Tu et al.，2007）；EIF2S3基因下调表达与结直肠癌（Quyun et al.，2010；Chang et al.，2014a，2014b）及非小细胞肺癌（Chian et al.，2016）显著相关。此外，EIF2S3可能通过影响eIF2的整体功能而影响动物机体的其他性状。Li等（2015）研究表明，EIF2S3基因是与鸡胸肌初始pH相关的一个候选基因。可见，EIF2S3基因在生物体内发挥着多种重要功能，如调控机体免疫及肌肉品质相关功能。【本研究切入点】目前，有关EIF2S3基因的研究主要集中在人类疾病方面，而在家畜、家禽等物种中的研究鲜见报道，对该基因的其他生物学功能也缺乏进一步探究。【拟解决的关键问题】以荣昌猪胸腺mRNA为模版，利用3"-RACE、5"-RACE和RT-PCR克隆猪EIF2S3基因mRNA，并对EIF2S3基因mRNA全长序列进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR分析EIF2S3基因的组织表达特征，以期为进一步研究猪eIF2蛋白γ亚基的生物学功能打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试猪品种为荣昌猪，由重庆市畜牧科学院荣昌猪国家资源保种场提供。mRNA提取、cDNA合成与反转录等试剂盒购自美国Clontech公司，DNA回收和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，pMD19-T载体及其他相关试剂均购自TaKaRa公司。
1. 2 组织RNA提取及cDNA合成
利用RNeasy® Mini Kit提取猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、胸腺及淋巴组织总RNA，并以Nanodrop 2000测定RNA浓度及其OD，RNA完整性采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。cDNA合成则参照试剂盒说明进行操作，总RNA用量均为1 μg。
1. 3 引物设计与合成
引物设计所需序列从NCBI数据库下载（NC_010461.5），采用Primer Premier 3.0进行设计，所有引物（表1）由苏州金唯智生物科技有限公司合成。