摘要：利用外源一氧化氮供体硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）处理、表皮条检测的方法研究了外源NO（nitric oxide）对拟南芥（Arabidopsis thaliana）气孔运动的影响。结果表明，随着外源NO浓度的增大，气孔关闭的效应也逐渐增大。但该效应可被c-PTIO逆转。此外，就内源NO在光、暗调控的气孔运动中的作用进行了讨论。
关键词：一氧化氮；拟南芥（Arabidopsis thaliana）；气孔运动
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）04-0835-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.006
Effects of Nitric Oxide on Stomatal Movement in Arabidopsis thaliana
ZHANG Yuan-hua，LIU Kai-hua
（College of Chemistry and Life Science， Weinan Normal University， Weinan 714099，Shaanxi，China）
Abstract： This article focused on the effect of nitric oxide on dark regulated stomatal movement in Arabidopsis thaliana， with the method of chemical trement by the exogenous donor of nitric oxide， sodium nitroprusside（SNP）， and determination of the stomatal aperture of the epidermal stripes in Arabidopsis. The results showed that the stomatal was closed with increasing concentration of exogenous NO in light. Conversely， it has no effect on stripes in darkness with the same treatment. But the darkness regulated stomatal closure can be reversed by c-PTIO and L-NAME. It indicated that NO could be activated by darkness and this high level of NO was responsible for the stomatal closure of Arabidopsis.
Key words： nitric oxide； Arabidopsis thaliana； stomatal movement
气孔是植物体与外界环境进行CO2、O2和水蒸气等气体交换的重要器官，许多生物和非生物因素都可以影响气孔运动[1]。一氧化氮（NO，nitric oxide）是一种广泛存在于植物体内且具有水溶性和脂溶性及自由基性质的气体活性分子。作为新型的信号分子，NO参与调节植物多种生理过程，如根的生长发育[2]、光形态建成[3]、种子萌发[4]、各种胁迫反应及抗病防御反应[5]、气孔运动[6]、细胞程序性死亡[7]、果实等组织的成熟及衰老[8]等。Neill等[9]报道NO是ABA诱导气孔关闭信号途径中的一个信号分子。NO的合成是ABA诱导气孔关闭所必需的，ABA增强了保卫细胞NO的合成，外源NO也可以促进气孔关闭，ABA以及NO对气孔关闭的诱导作用需要cGMP以及cADPR的合成与参与[10]。此外，大量证据表明，NO参与暗反应[11]及UV-B[12]、水杨酸[13]、茉莉酸[14]、细胞分裂素和生长素等物质合成，均能诱导气孔关闭[15]。然而，关于NO与光/暗诱导气孔运动的关系相对较少。因此，本研究以拟南芥叶片下表皮为材料，通过观察外源NO供体硝普钠（sodium nitroprusside， SNP）对气孔运动的影响，初步探索NO在光/暗调控气孔运动中的可能作用，以期为进一步探索保卫细胞信号转导途径积累资料。
1 材料与方法
1.1 材料
选取大小一致、子粒饱满的拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子，均匀播种于营养钵中，每钵2～3株，然后在人工气候箱中培养，光/暗周期为14 h/10 h，光周期的光照强度为300 μmol/（m2·s），温度为25 ℃/18 ℃，相对湿度75%。幼苗生长期间每天浇水1次，无任何水分胁迫。待幼苗长至4～6周龄时取上部完全展开、光照充分的叶片作为试验材料。
1.2 试剂
SNP（sodium nitroprusside，NO供体），L-NAME（NG-nitro-L-arginine methyl ester， 动物NOS抑制剂），c-PTIO（carboxy-2-phenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline，NO特异的清除剂），MES[2-（N- morpholino） ethanesulfonic acid，2-（N-吗啡琳）乙烷磺酸]均购自Sigma公司，DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）购自Amresco公司，其他均为国产分析纯试剂。
1.3 气孔开度的测定
取4～6周龄拟南芥幼苗顶部生长良好、完全伸展、光照充分的叶片，用镊子撕取其下表皮，再用毛刷除去下表皮上黏附的叶肉细胞，然后将其置于MES-KCl缓冲液（MES 10 mmol/L， KCl 50 mmol/L， pH 6.15）中，制成适度大小的表皮条。然后将新鲜表皮条置于25 ℃、相对湿度80%的培养箱中进行各项处理。光处理光照强度300 mol/（m2·s），于限度时间在显微镜（Nikon TE 300）下用测微尺测量气孔孔径，测量时每次随机选取4个视野，每个视野随机选取5个气孔，每处理均重复3次以上。
所得数据计算平均值和标准误差并用one-way AVOVA分析（Duncan分析，α=0.05水平）。
2 结果与分析
2.1 不同浓度SNP对光下气孔开度的影响
由图1可知，所示浓度NO均表现出促进气孔关闭的效应，且随浓度的增加促进效应逐渐增大。10 μmol/L的NO促进效应最小，100 μmol/L的NO可以使气孔开度减小54.92%，而1 000 μmol/L的NO虽然能有效促进气孔关闭（与对照相比，气孔孔径减小了60.68%），但已使叶片细胞受到了一定程度的伤害。因此在后续试验选择SNP 100 μmol/L为最适浓度。
2.2 不同浓度SNP对暗处理中气孔开度的影响
由图2可知，暗处理能诱导气孔关闭，但浓度递增的SNP处理后表皮条的开度并未发生明显变化。结果表明，SNP对暗诱导的气孔运动没有影响，或作用很小。
2.3 c-PTIO和L-NAME对光下SNP诱导气孔运动的影响
为了进一步研究光下SNP诱导气孔关闭的机制，利用L-NAME和c-PTIO分别与SNP共处理的方法探究NO是否参与诱导光下气孔关闭。L-NAME是NOS合成抑制剂，能够有效抑制植物体内NO的生物合成；c-PTIO为NO清除剂，能够清除植物体内生成的NO。试验中采用的L-NAME和c-PTIO的浓度均为100 μmol/L。由图3可见，100 μmol/L的c-PTIO能有效抑制光下SNP诱导的气孔关闭（P<0.05），但100 μmol/L的L-NAME却不能抑制SNP诱导的气孔关闭。结果表明，光下气孔开放可能与表皮条内较低的NO水平有关，较高浓度的NO能够诱导气孔关闭。
2.4 c-PTIO和L-NAME对暗诱导气孔关闭的影响
为了探明暗处理与NO水平的关系，用c-PTIO和L-NAME对暗环境中的表皮条进行处理，结果如图4所示。由图4可知，暗诱导拟南芥离体表皮条气孔关闭，但经NOS抑制剂L-NAME与c-PTIO处理后，表皮条的气孔开度分别增大了52.7%和60.1%，差异显著（P<0.05）。结果表明，暗环境中表皮条内的NO水平相对光下较高，暗环境能够诱导气孔保卫细胞产生NO，而产生的NO积累后可能进一步诱导气孔关闭。但是，通过NOS合成NO的途径可被其合成抑制剂所阻断，因此，暗处理中用L-NAME处理的表皮条气孔并未关闭，即阻断暗诱导的气孔关闭。对于通过其他途径已经产生或正在产生的NO，经c-PTIO的清除作用处理后，同样能够阻止暗诱导气孔关闭。
3 小结
前人的研究表明，NO能够作为植物体内重要的信号分子，参与调节植物体的生长发育、防御反应、基因表达和细胞凋亡等生理过程[16]，也有研究发现NO介导脱落酸（ABA）[9]和水杨酸（SA）[13]促进气孔关闭的效应。通过对拟南芥表皮条的研究发现，外源NO能明显促进叶片下表皮气孔关闭，这与彭俊玲等[17]的观点一致。然而，暗能诱导气孔关闭，但外源NO对暗处理下的表皮条气孔开度没有影响。因此，为了探明NO在植物气孔运动中的作用，又利用NOS的合成抑制剂L-NAME和NO清除剂c-PTIO对光下拟南芥叶片下表皮进行处理，结果表明，内源合成的NO能够诱导气孔关闭，该结果与李建华等[18]的研究结果一致。同样，为了进一步证实NO能够诱导气孔关闭的结论，通过暗处理中加入合成抑制剂L-NAME和NO清除剂c-PTIO的方式进行了验证。结果表明，L-NAME和c-PTIO能显著抑制暗处理中气孔的关闭。由研究结论推断，暗处理能诱导内源NO的产生，并且NO作为重要的信号分子参与光/暗调控的气孔运动，暗诱导的气孔关闭是通过下游NO信号分子的参与实现的，与穆娟等[19]的研究结果一致。
参考文献：
[1] SADDEN W A， BLUM W E. Activation of a plant plasma membrane Ca2+ channel by TGα1， a hetero trimeric G protein-subunit homologue[J]. FEBS Lett，1998，424：17-21.
[2] PAGNUSSAT G C SIMONTACCHI M， PUNTARULO S， et al. Nitric oxide is required for root organogenesis[J]. Plant Physiology，2002，129（3）：954-956.
[3] GRAZIANO M， BELIGNI M V， LAMATTINA L. Nitric oxide improves iron availability in plants[J]. Plant Physiology，2002， 130：1852-1859.
[4] 张秀玮，董元杰，邱现奎，等.外源NO对不同作物种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响[J].植物营养与肥料学报，2012，18（2）：397-404.
[5] DELLEDONNE M， XIA Y J，DIXON R A，et al.Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance[J]. Nature，1998，394：585-588.
[6] DESIKAN R，GRIFFITHS R，HANCOCK J， et al. A new role for an old enzyme：nitrate reductase-mediated nitric oxide generation is required for abscisic acid-induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA，2002，99（25）：16314-16318.
[7] LESHEM Y Y， WILLS R B H， KU V V. Evidence for the function of the free radical gas nitric oxide（NO） as an endogenous maturation and senescellce regulating factor in higher plants[J]. Plant Physiology and Boichemistry，1998，36（11）： 825-833.
[8] GUO F Q， CRAWFORD N M. Arabidopsis nitric oxide synthase1 is targeted to mitochondria and protects against oxidative damage and dark-induced senescence[J]. The Plant Cell， 2005，17（12）：3436-3450.
[9] NEILL S J， DESIKAN R， CLARKE A， et al. Nitric oxide is a novel component of abscisic acid signalling in stomatal guard cells[J]. Plant Physiology，2002，128：13-16.
[10] DURNER J， WENDEHENNE D， KLESSIG D F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide， cyclic GMP， and cyclic ADP-ribose[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（17）： 10328-10333.
[11] SHE X P， SONG X G， HE J M. Role and relationship of nitric oxide and hydrogen peroxide in light/dark-regulated stomatal movement in Vicia faba[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（11）：1292-1300.
[12] HE J M， XU H， SHE X P， et al. The role and the interrelationship of hydrogen peroxide and nitric oxide in the UV-B-induced stomatal closure in broad bean[J]. Functional Plant Biology，2005，32（3）：237-247.
[13] LIU X，ZHANG S Q， LOU C H. Involvement of nitric oxide in the signal transduction of salicylic acid regulating stomatal movement[J]. Chinese Science Bulletin，2003，48（5）：449-452.
[14] LIU X， SHI W L， ZHANG S Q， et al. Nitric oxide involved in signal transduction of jasmonic acid-induced stomatal closure of Vicia faba L.[J].Chinese Science Bulletin，2005，50（6）： 520-525.
[15] SHE X P， SONG X G. Cytokinin- and auxin-induced stomatal opening is related to the change of nitric oxide levels in guard cells in broad bean[J]. Physiologia Plantarum， 2006， 128：569-579.
[16] LAMOTTE O， COURTOIS C， BARNAVON L， et al. Nitric oxide in plants： the biosynthesis and cell signalling properties of a fascinating molecule[J]. Plants，2005，221：1-4.
[17] 彭俊玲，马三梅.外源ABA、NO对葱鳞茎上气孔运动的影响[J].江苏农业科学，2011，39（6）：262-264.
[18] 李建华，吕 品，刘银谦，等.一氧化氮可能参与细胞外钙调素诱导蚕豆气孔关闭的过程[J].自然科学进展，2007，17（4）：428-434.
[19] 穆 娟，余小平.CO在光/暗调控蚕豆气孔运动中的作用及其与NO、H2O2的相互关系研究[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2009，37（5）：78-81.