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G^B 4L L L-nSM00 `ds۔ 40 1L`M1 `OomG{]6ӭNM{]6mܘwm:ێӭxNG{]6ӭky"http://www.51feid.com/keys/kaifang.html" target="_blank" class="keylink">开放，甚至出现结球现象。综上所述，He102的现蕾、抽薹和开花均不依赖长日照，06-247的现蕾对长日照依赖性不强、而抽薹和开花则必须在长日照下才能进行。由此推断，大白菜的花芽分化（现蕾）与抽薹开花可能受不同的基因控制，属于不同的农艺性状。利用自然日照长短的变化，将试验一/二与试验三结合，可以有效鉴定大白菜抽薹开花对长日照的依赖性。
2.2CCA1全长cDNA克隆及氨基酸序列分析
CCA1是模式植物拟南芥中调控光周期的关键转录因子，因此本研究采用同源克隆技术克隆了两材料中CCA1全长cDNA，PCR扩增结果如图1所示。经测序验证，发现长日照依赖型耐抽薹材料06-247的CCA1编码区长1 659 bp，与BRAD数据库中Chifu-401的序列完全同源，而来自长日照不依赖型极易抽薹材料He102的CCA1编码区长1 671 bp。后者除了比前者多两处6 bp的插入外，整个编码区还有23处SNPs（图2A），其中14处是非同义突变，造成不同氨基酸的替换突变（图2B）。经预测，前者编码产物包含552个氨基酸残基，后者包含556个，二者分子量分别是60.14 kD和60.58 kD。
图206-247与He102的CCA1编码区序列（A）及氨基酸序列（B）比较依据全长cDNA推导的氨基酸序列差异见表2。在两材料CCA1全长cDNA之间的两处6 bp插入/缺失中，第一处是t.329_330 ins CGGAAG，使He102的CCA1 蛋白第112位后的氨基酸插入Gly和Ser两个残基；第二处是t.1407_1408 ins CAACAA，导致He102的CCA1在469位氨基酸之后插入两个Gln （图2B）。其余非同义突变造成不同氨基酸的替换，其中性质差异较大的有118 Pro>Thr、119 Gly>Cys、125 Glu>Gln、176 Asn>Lys、440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、465 Lys>Gln、467 Glu>Lys。另外，440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、528 Ser>Asn、529 Asn>Ser与丝氨酸的替换有关，是潜在的磷酸化修饰位点。
根据拟南芥CCA1的结构域分布特点，He102中的突变位点主要位于第113位氨基酸之后，主要在蛋白-蛋白相互作用区和磷酸化修饰区。上述性质差异较大的氨基酸替换突变，位于蛋白-蛋白相互作用结构域的有可能影响CCA1的空间折叠结构，而位于C端与丝氨酸有关的四处突变可能影响磷酸化修饰位点。
2.3基于小片段插入缺失的共显性标记开发
06-247与He102的CCA1编码区两处小片段插入/缺失大小仅为6 bp，一处靠近5′端，另一处靠近3′端。在突变区域两侧保守区设计引物，使扩增片段介于100～200 bp间，用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳对扩增片段进行检测，结果见图3A，表明6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够很好地区分6 bp的差异。用其中位于3′端的标记检测了部分大白菜资源（图3B），从图中可以看出，所开发的标记扩增条带清晰、没有杂带干扰，适合用于种质资源的基因型筛查。
3讨论与结论
耐抽薹大白菜种质的创新是春白菜育种的关键，而耐抽薹性状的正确评价及有效筛选直接关系到耐抽薹种质的创新效率。大白菜耐抽薹性状的评价方法较多，大都采用不同的低温春化处理，根据处理一定时间后材料的现蕾和开花早晚来判断其耐抽薹性，且一般将现蕾期、始花期和始花期薹长共同作为判定耐抽薹的标准[10，11]。这在一定程度上增加了耐抽薹性状QTL定位研究的复杂性，难以得到精细的定位结果。如张磊[12]利用类似的耐抽薹鉴定方法定位了9个与耐抽薹有关的QTLs，于拴仓[13]则定位了6个。有的研究者虽然注意到光周期对一些大白菜抽薹开花有影响，也发现现蕾和抽薹不一致[14，15]，但并未提出长日照依赖型抽薹开花的概念，仍将现蕾、抽薹、开花综合作为耐抽薹性状。本研究首次发现06-247与He102现蕾和抽薹是两个独立的性状，为下一步耐抽薹性状精细解析和精准定位奠定了基础。本研究试验二和试验三相结合，可以有效判定大白菜材料的抽薹开花是否依赖长日照，为长日照依赖型表型鉴定提供了新的方法。
自然界日照长短是恒定变化的环境因子，植物为了响应光周期的变化，进化出复杂的调控机制。本研究基于模式植物拟南芥光周期诱导开花的调控机制，从光周期关键调控因子CCA1着手，发现06-247与He102的CCA1在蛋白-蛋白结合区和磷酸化修饰区存在氨基酸插入/缺失和替换突变。这可能导致两者CCA1蛋白功能的差异，从而导致两材料对光周期敏感程度不同，即CCA1是潜在的光周期调控关键功能基因。基于编码区小片段插入/缺失的差异，本研究开发出区分两个大白菜品种的共显性分子标记，该标记位于功能基因内部，是潜在的功能标记，为下一步耐抽薹种质筛选、耐抽薹大白菜新品种辅助育种及耐抽薹性状精细定位研究提供了可供选择的标记。
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