工作。本研究以余甘子鲜果为原料，探究高温蒸汽、微波及沸水3种漂烫方式对过氧化物酶酶活性的影响。结果表明高温蒸汽漂烫对POD和PPO的钝化效果较好，且耗时短。
关键词：余甘子;漂烫;多酚氧化酶;过氧化物酶
Abstract：In order to solve the problem of browning in the process of Phyllanthus emblica， the pretreatment is required. In this study， the effects of high temperature steam， microwave and boiling water on the activities of peroxidase and polyphenol oxidase were investigated. The results show that high temperature steam blanching has better passivation effect on POD and PPO， and it takes less time.
Key words：Phyllanthus emblica L; Blanching; Polyphenol oxidase; Peroxidase
中图分类号：R284.1
余甘子（Phyllanthus emblica L.）属大戟科叶下珠属小乔木或灌木，是西南地区重要的野生资源[1]。我国余甘子品种资源非常丰富，栽培历史悠久，有2 000多年的栽培历史，具有良好的开发前景。余甘子含有多酚類、有机酸、黄酮类、多糖、维生素、蛋白质、氨基酸和多种矿物质等[2-4]，具有利咽生津、化痰止咳、护肝、改善动脉硬化、抗氧化、抗菌、抗疲劳、抗糖尿病和抗肿瘤等功效[5-8]，应用领域广阔，但是作为一种重要的药食同源植物，余甘子高度易腐，室温下不能久置，如有水分可加速褐变腐烂。近年来，余甘子的产量呈迅速上升之势，但常因保鲜不当导致大量余甘子腐烂，造成很大的资源浪费和经济损失。
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）广泛存在于果蔬中，是引起酶促褐变的关键酶[9]。所以大多数果蔬在冷冻加工前进行漂烫处理，其目的是钝化酶的活性、排除氧气，从而抑制酶促褐变[10]。因此，为了解决余甘子果在加工过程中的褐变问题，利用高温蒸汽、微波、热水三种漂烫方式对余甘子鲜果进行处理，分析单因素对多酚氧化酶和过氧化物酶活性的影响，拟为余甘子的深加工提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
余甘子鲜果（果实直径约为15 mm），由中国林业和草原科学研究院资源昆虫研究所景东南亚热带试验站提供;过氧化氢、三氯乙酸、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠，天津市风船化学试剂科技有限公司生产;聚乙二醇辛基苯基醚，阿拉丁试剂（上海）有限公司生产;焦性没食子酸，重庆川东化工集团有限公司生产;愈创木酚，上海晶纯实业有限公司生产;液氮（纯度≥99.99%），昆明梅塞尔气体产品有限公司生产;以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅（型号：HHS-11-2，江苏省医疗器械厂）;超声微波组合反应系统（型号：XO-SM，南京先欧生物科技有限公司）;电加热蒸汽发生器（型号：HX-7.5D，上海华征特种锅炉有限公司）;紫外分光光度计（DU800，美国贝克曼库尔特有限公司）;恒温磁力搅拌器（DF101-S，郑州南北仪器公司）;电子天平（型号：BP2215，德国赛多利斯公司）;通用型高速冷冻离心机（型号：Z323K，德国Hermie公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 余甘子酶液提取
酶液提取参照蒋跃明[11]和Aydemir T等[12]的方法，略做修改。实验在4 ℃下进行。10 g余甘子果肉用液氮冷冻后迅速转入打粉机磨成细粉，适当解冻后加入100 mL提取液[pH为6.5，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液+聚乙二醇辛基苯基醚（1%，v/v）]，冰浴研磨成匀浆，过滤，取50 mL滤液于4 ℃、8 000 r·min-1离心10 min。上清液保存于4 ℃冰箱中备用。
1.3.2 酶活测定
（1）PPO活性测定。PPO活性测定采用晏绍庆[13]等的测定方法并稍作修改。将焦性没食子酸用0.2 mol·L-1（pH为6.5）的磷酸盐缓冲溶液配制成0.1 mol·L-1的溶液作为酶的底物，取底物溶液5.6 mL，再加入粗酶液0.4 mL，于30 ℃下保温5 min。然后在波长420 nm处比色，测定吸光度A，计算PPO的活性。以每毫升酶液反应后每分钟吸光度值增加0.001定义为1个酶活单位（U），将未处理余甘子果的PPO酶活定为100%，其他条件处理后的酶活与其相比较计算其相对酶活，重复3次。PPO活性计算公式，见式（1）。
（1）式（1）中，ΔA420nm为样品吸光度与空白对照吸光度之差;VT为提取酶液总体积（mL）;W为待测材料质量（g）;VS为测定时取用酶液体积（mL）;t为反应时间（min）。PPO活性单位为U·g-1·min-1。
（2）POD活性测定。POD活性测定采用愈创木酚法[14]。反应体系是0.05 mol·L-1、pH为6.5的磷酸缓冲液2.9 mL、2%过氧化氢1.0 mL、0.05 mol·L-1愈创木酚溶液、1.0 mL和0.1 mL的酶液。加入酶液后，立即放置在30 ℃水浴中保温5 min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0 mL 5%的三氯乙酸终止反应，在波长470 nm处比色，测定吸光度A，计算POD的活性。以每毫升酶液反应后每分钟吸光度值增加0.01定义为1个酶活单位（U），将未处理余甘子果的POD酶活定为100%，其他条件处理后的酶活与其相比较，按照公式（2）计算其相对酶活，重复3次。
（2）式（2）中，ΔA470nm为样品吸光度与空白对照吸光度之差;VT为提取酶液总体积（mL）;W为待测材料质量（g）;VS为测定时取用酶液体积（mL）;t为反应时间（min）。POD活性单位为U·g-1·min-1。
1.4 单因素试验
1.4.1 高温蒸汽处理
（1）不同蒸汽压力处理。称取余甘子鲜果100 g，控制蒸汽压力分别为0.1、0.2、0.3、0.4 MPa和0.5 MPa
对其处理50 s，研究不同蒸汽压力对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
（2）不同蒸汽时间处理。称取余甘子鲜果100 g，控制蒸汽压力为0.3 MPa，对余甘子鲜果分别处理30、40、50、60、70、90、110 s和130 s，研究不同蒸汽时间对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
（3）不同载料量处理。在蒸汽压力为0.3 MPa时，在载料量分别为50、100、150、200 g和250 g条件下对余甘子鲜果进行高温蒸汽处理50 s，研究不同载料量对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
1.4.2 微波漂烫处理
（1）不同微波功率处理。称取余甘子鲜果100 g，控制微波功率分别为100、200、300、400 W和500 W对其处理8 min，考察不同微波功率对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
（2）不同微波时间处理。称取余甘子鲜果100 g，控制蒸汽压力为400 W，对余甘子鲜果分别处理0、2、4、6 min和8 min，考察不同微波时间对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
1.4.3 沸水漂烫处理
（1）不同漂烫温度处理。称取余甘子鲜果100 g，控制温度分别为50、60、70、80 ℃和90 ℃對其处理10 min，研究不同漂烫温度对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
（2）不同漂烫时间处理。称取余甘子鲜果100 g，控制温度为90 ℃，对余甘子鲜果分别处理2、4、6、8、10、20 min和30 min，研究不同漂烫时间对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
（3）不同液料比处理。在温度为90 ℃时，在液体体积分别为100、200、300、400 mL和500 mL条件下对100 g余甘子鲜果进行漂烫处理10 min，研究不同液料比对余甘子的PPO、POD酶活的影响。
2 结果与分析
2.1 高温蒸汽处理对POD和PPO相对酶活的影响
2.1.1 载料量对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
在蒸汽压力和蒸汽处理时间一定的条件下，随着载料量的增加，余甘子果中POD和PPO酶活性逐渐上升，如图1所示，可能原因是物料增多，余甘子果堆积使其与高温蒸汽接触面积减小。当载料量超过100 g时，余甘子POD和PPO酶活性上升较为迅速，POD相对酶活从40.50%上升到77.73%，PPO相对酶活从36.22%上升到63.09%。
图1 载料量对POD和PPO相对酶活的影响图
2.1.2 蒸汽压力对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
蒸汽压力对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活性的影响如图2所示。从图中可以看出，余甘子POD、PPO酶活性随蒸汽压力的增加而快速降低。当蒸汽压力为0.5 MPa时，POD相对酶活性降到最低，酶活性为16.28 U·g-1·min-1。这说明过氧化物酶在高温蒸汽处理条件下很容易失活，但较大的蒸汽压力对应着较高的蒸汽温度，使余甘子鲜果加速变软颜色变黄，造成余甘子品质及外观品质受损严重。
图2 蒸汽压力对POD和PPO相对酶活的影响图
2.1.3 蒸汽时间对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
余甘子POD和PPO酶活性随蒸汽时间的延长，酶活性下降明显，如图3所示，随着蒸汽处理时间的延长，累积的热量也逐渐增加，从而导致余甘子中过氧化物和多酚类物质被分解。若蒸汽处理时间较短，达不到钝化酶的效果，处理时间过长，虽然能完全钝化过氧化物酶和多酚氧化酶，但余甘子中的营养成分可能会大量损失。
图3 蒸汽时间对POD和PPO相对酶活的影响图
2.2 微波漂烫处理对POD和PPO相对酶活的影响
2.2.1 微波功率对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
微波漂烫功率对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活性的影响如图4所示。从图中可以看出，余甘子POD和PPO酶活性随微波功率的增加而快速降低。其中PPO相对酶活性较高温蒸汽处理时相比降得很快，当微波功率为500 W时，PPO相对酶活性降到最低，仅有4.66%，酶活性为89 U·g-1·min-1。这说明多酚氧化酶在微波漂烫处理条件下很容易失活，但较大的功率对应着较高的温度，使余甘子加速软化颜色变黄，造成余甘子品质及外观品质受损严重。
图4 微波功率对POD和PPO相对酶活的影响图
2.2.2 微波时间对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
由图5知，余甘子鲜果POD的相对酶活性随时间的延长而降低，PPO和POD的相对酶活性在0～2 min内均急剧降低，但是PPO的相对酶活性在2～4 min内上升了7.17个百分点，这可能是因为在2 min后，微波处理激活了余甘子鲜果内PPO的酶活性[15]。
图5 微波漂烫时间对POD和PPO相对酶活的影响图
2.3 沸水漂烫处理对POD和PPO相对酶活的影响
2.3.1 液体温度对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
液料的温度对余甘子鲜果POD和PPO酶活性的影响如图6所示。由图中可知，在漂烫时间和载料量固定的条件下，余甘子POD和PPO酶活性随水温的增加，酶活性下降明显，随着水温的增加，累积的热量也逐渐增加，从而导致余甘子中过氧化物和多酚类物质被分解。若处理温度较低，达不到钝化酶的效果，处理温度过高，虽然能完全钝化过氧化物酶和多酚氧化酶，但余甘子中的营养成分可能会大量损失。
图6 漂烫温度对POD和PPO相对酶活的影响图
2.3.2 沸水漂烫时间对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
余甘子POD和PPO酶活性随微波处理时间的延长，酶活性下降明显如图7所示，POD相对酶活性在2～10 min内急剧降低，10 min以后下降较缓慢，而PPO相对酶活性在10～20 min内下降较快。若蒸汽处理时间较短，达不到钝化酶的效果，处理时间过长，虽然能完全钝化过氧化物酶和多酚氧化酶，但余甘子中的营养成分可能会大量损失。
2.3.3 液料比对余甘子鲜果POD和PPO相对酶活的影响
液料比对余甘子鲜果POD和PPO酶活性的影响如图8所示。由图中可知，在余甘子质量、处理温度和处理时间一定的条件下，随着液体体积的增加，余甘子鲜果中POD和PPO酶活性逐渐下降，这可能是液料增多，余甘子果完全浸没在液体中，与液体接触面积增大有关。当液料超过300 mL即料液比为1∶3时，余甘子POD相对酶活性下降较为迅速。
图7 漂烫时间对POD和PPO相对酶活的影响图
图8 液料比对POD和PPO相对酶活的影响图
3 结论
当高温蒸汽处理时间在130 s时，余甘子鲜果中的POD和PPO相对酶活分别为15.47%和10.30%;沸水处理30 min后，余甘子鲜果中的POD和PPO相对酶活分别为12.72%和8.61%;微波处理8 min后，余甘子鲜果中的POD和PPO相对酶活分别为22.59%和9.11%。由此可见，3种处理余甘子的方式中，从实验的角度来说高温蒸汽漂烫对POD和PPO钝化效果较好，且耗时短。
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