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[摘要] 该文对桂枝茯苓胶囊及其15个活性成分组合物进行免疫调节活性评价，并对其作用机制进行初步探索。实验通过MTT法检测脾脏淋巴细胞体外增殖活化能力，观察桂枝茯苓胶囊及其活性成分组合物促淋巴细胞增殖作用;通过流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中CD80/86，CD3CD25，CD3CD69的比例变化，评价桂枝茯苓胶囊及其活性成分组合物对脾脏淋巴细胞活化的影响。MTT结果显示400 mg·L<sup>-1</sup>的桂枝茯苓胶囊可以明显促进脾淋巴细胞的体外增殖，与对照组比较，差异具有统计学意义（P≤0.01）;15种活性成分组合物也具有相同的作用，在25～800 mg·L<sup>-1</sup>，与对照组比较，差异具有统计学意义（P≤0.01），且在6.25～400 mg·L<sup>-1</sup>呈现明显的量效关系。流式细胞术结果显示400 mg·L<sup>-1</sup>桂枝茯苓胶囊与200 mg·L<sup>-1</sup>的15种活性成分组合物对脾淋巴细胞中CD80和CD86的表达均具有明显的促进作用;对CD3+细胞中CD69和CD25的表达亦具有明显促进作用。综上，桂枝茯苓胶囊与其活性成分组合物具有一定的免疫调节活性，其机制可能与活化淋巴细胞密切相关。
[关键词] 桂枝茯苓胶囊;活性成分组合物;免疫调节活性;机制
[收稿日期] 2015-02-05
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（ 2013ZX09402203）
[通信作者] *萧伟，博士，研究员级高级工程师，研究方向为中药新药的研究与开发，Tel：（0518）81152337，E-mail： wzhzh-nj@163.net
Research on immune-modulation effects and its mechanisms of
Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination
JIANG Yi-ping， WU Xiu， LI Na， CAO Liang， DING Gang， WANG Zhen-zhong， XIAO Wei*
（Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] The effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination within different concentration on SPL proliferate were observed by MTT method. The ratio of CD80/86，CD3CD25 and CD3CD69 was used to evaluate cell activation effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination by FCM. Guizhi Fuling capsule with concentration of 400 mg·L<sup>-1</sup>can promote spleen lymphocyte proliferation， as well as the active ingredient combination， which showed the obvious dose-effect relationship. Compared with control group， the difference has statistical significance （P≤0.01）. The result of FCM showed that Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination can promote CD80 and CD86 expression on spleen lymphocyte， and also can increase CD25 and CD69 ratio between spleen CD3+ cells. Compared with control group， the difference has statistical significance （P≤0.01）. Thus， Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination may have immune-modulate effects， and the mechanism may have a close relationship with the lymphocyte activation.
[Key words] Guizhi Fuling capsule; active ingredient combination; immune-modulation; mechanisms
doi：10.4268/cjcmm20151529
桂枝茯苓胶囊是古方桂枝茯苓丸的现代剂型。它有抑制血小板聚集、降低血黏度、缓解子宫痉挛、镇痛等作用，能活血化瘀、缓消症块，用于治疗妇科血瘀症、子宫肌瘤、慢性盆腔炎、卵巢囊肿、痛经等[1]。现代药理学研究显示，桂枝茯苓胶囊所含桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓5味中药中的很多活性成分均具有免疫调节的作用[2-4]。本研究将前期在桂枝茯苓胶囊中发现的15个活性单体化合物按照制剂中含量比例进行配比组合，与桂枝茯苓胶囊一同进行免疫调节活性研究及其作用机制探讨。
1 材料
纯水仪（美国Millipore公司Q-Plus）;电子分析天平（德国Sartorius，d=0.1 mg）;多功能酶标仪（瑞士TECAN）;台式冷冻离心机（美国Beckman）;细胞培养箱（日本SANYO公司）;倒置显微镜（OLYMPUS，PM-10AD）;微量震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，MH-2）;漩涡震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-901）;微量加样器（法国GILSON）;6孔、96孔细胞培养板（美国CORNING）;一次性滤膜（membrane pore size 0.22 μm，PALL产品）。
没食子酸、芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、苦杏仁苷、香豆素、肉桂酸、苯甲酰芍药苷、茯苓酸、槲皮素、五没食子酰葡萄糖、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、白芍苷和茯苓多糖15种活性成分组合物与桂枝茯苓胶囊由江苏康缘药业股份有限公司提供。
RPMI 1640培养液（GIBCO）;刀豆蛋白A（ConA，SIGMA）;胎牛血清（FBS，PAA）;MTT（SIGMA）;2-巯基乙醇（2-Me，美国M3148）;二甲基亚砜（DMSO，SIGMA）;青/链霉素（SIGMA/NEUPROBE）。
磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na<sub>2</sub>HPO4·12H<sub>2</sub>O 2.08 g，KH<sub>2</sub>PO4 0.20 g，超纯水分别溶解，并定容至1 000 mL，pH 7.2，120～125 ℃高压灭菌，以上各试剂均为分析纯。高渗盐水：1.8 g NaCl溶于100 mL RO水中，高压灭菌。
BALB/c小鼠，♂，6～8周龄（15～22 g），常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号SCXK（苏）2011-0003。
2 方法
2.1 药物对脾淋巴细胞的促增殖作用（MTT法） 常规制备小鼠脾淋巴细胞，将细胞按190 μL/孔（3.8×105个/孔）接种到96孔培养板中，分设细胞对照孔、ConA刺激孔（质控）、桂枝茯苓胶囊（GZFL）制剂孔、组合物不同浓度孔（ZHW）及单纯培养液的调零孔，各设3个复孔。其中ConA刺激孔加入0.1 g·L<sup>-1</sup>ConA 10 μL（终浓度5 mg·L<sup>-1</sup>），ZHW组加入125，250，500，1 000，2 000，4 000，8 000，16 000 mg·L<sup>-1</sup>的组合物10 μL（终浓度分别为6.25，12.5，25，50，100，200，400，800 mg·L<sup>-1</sup>），GZFL组加入8 g·L<sup>-1</sup>的GZFL 10 μL（终浓度400 mg·L<sup>-1</sup>），细胞对照孔加入10 μL培养液补足体积。37 ℃，5% CO<sub>2</sub>，饱和湿度下培养48 h。
在培养结束前4 h，每孔加入5 g·L<sup>-1</sup> MTT 20 μL，4 h后，300×g常温离心10 min，小心吸弃上清200 μL，加入150 μL DMSO，培养箱中放置10 min后，微量震荡仪震荡5 min，观察孔中颜色均匀后，酶标仪检测波长570 nm，参比波长630 nm检测各孔的光密度值（OD）。
2.2 药物对脾淋巴细胞活化水平的影响（流式细胞术法） 常规制备脾淋巴细胞，调整细胞浓度，将细胞按3.8×105/孔（190 μL）接种到96孔培养板中，分设细胞对照孔、ConA刺激孔（质控）、组合物孔（ZHW），GZFL孔及单纯培养液的调零孔，各设3个复孔，一共设2组。其中ConA刺激孔加入0.1 g·L<sup>-1</sup>的ConA 10 μL（终浓度5 mg·L<sup>-1</sup>），ZHW组加入4 g·L<sup>-1</sup>的药物10 μL（终浓度200 mg·L<sup>-1</sup>），GZFL孔加入8 g·L<sup>-1</sup>的GZFL 10 μL（终浓度400 mg·L<sup>-1</sup>），细胞对照孔加入10 μL培养液补足体积。37 ℃，5% CO<sub>2</sub>，饱和湿度下培养48 h。
培养48 h后，收集各孔细胞，用3 mL PBS重悬，洗涤细胞2次后，100 μL PBS重悬细胞。2组细胞分别加入PE-anti-mouse CD80，APC-anti-mouse CD86和FITC-anti-mouse CD3，PE-anti-mouse CD25，APC-anti-mouse CD69。各管混匀室温避光孵育，20 min后，PBS洗涤细胞2次，4 ℃，300×g离心10 min，弃上清，200 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。
3 结果
3.1 药物对脾淋巴细胞的促增殖作用 ZHW组对SPL具有明显的促增殖转化作用，并在6.25～200 mg·L<sup>-1</sup>呈现明显的量效关系;GZFL制剂组在终浓度400 mg·L<sup>-1</sup>的作用下，亦可以促进SPL的体外增殖（表1）。ConA刺激孔用于检测SPL活性，确保实验结果的客观性和准确性，结果不在下面的图表中显示。
3.2 药物对脾淋巴细胞活化水平的影响 ZHW组对SPL细胞中CD80和CD86的表达水平具有明显的上调作用，GZFL制剂的作用与组合物作用类似，
表1 MTT法检测GZFL与ZHW对SPL体外增殖活化的影响（±s，n=3）
Table 1 The effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination on SPL proliferate by MTT method（±s，n=3）
注：1）与对照组相比P<0.01（表2，3同）。
同样可以增加SPL中CD80和CD86的细胞比例（表2，图1）。ZHW对SPLCD3+细胞中CD69和CD25的表达具有明显的促进作用，GZFL制剂的作用与ZHW作用类似，可以上调SPL中T细胞CD69和CD25的表达水平（表3，图2）。
表2 GZFL与ZHW对SPL CD80+/CD86+细胞比例的影响（±s，n=3）
Table 2 The effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination on CD80+/CD86+ percentage of SPL（±s，n=3）
组别剂量/mg·L<sup>-1</sup>CD80+/%CD86+/%
对照7.50±2.236.90±1.30
ZHW20023.13±3.011）15.51±2.121）
GZFL40025.10±3.001）19.01±1.541）
4 讨论
桂枝茯苓胶囊方药中桂枝能化气，温通血脉;茯苓渗利湿气，又益心脾之气，使脾土健运，从而痰生无源;丹皮、赤芍，合桃仁化瘀血，清瘀热。桂枝、芍药，一阳一阴，茯苓、丹皮，一气一血，诸药合用，共奏其效，使得阴阳调和，气血流畅，“通则不痛”，达到活血化瘀，缓解疼痛，缓消癥块的目的。近年来，桂枝茯苓丸在妇科疾病的临床运用上已远远超过了原方的使用范围，取得良好的疗效，积累了丰富的经验;该药治疗慢性盆腔炎的疗效也很显著，被广泛用于临床治疗盆腔炎。近年来，许多国内外学者对该
图1 GZFL与ZHW对SPL CD80+/CD86+细胞比例影响的流式代表图
Fig.1 FCM figure for the effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination on CD80+/CD86+ percentage of SPL
表3 GZFL与ZHW对SPL中T细胞CD69+和CD25+细胞比例的影响（±s，n=3）
Table 3 The effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination on CD69+ and CD25+ percentage of spleen T lymphocyte cells（±s，n=3）
药物剂量/mg·L<sup>-1</sup>CD3+CD69+/%CD3+CD25+/%
对照19.53±3.340.60±0.01
ZHW20035.33±2.561）7.01±0.891）
GZFL40036.28±3.011）7.50±1.011）
图2 GZFL与ZHW对SPL中T细胞CD69+和CD25+细胞比例影响的流式代表图
Fig.2 FCM figure for the effects of Guizhi Fuling capsule and its active ingredient combination on CD69+ and CD25+ percentage of spleen T lymphocyte cells
方的药理作用进行了大量的研究，表明桂枝茯苓在抗炎、调节免疫等方面具有良好作用[5-7]。
前期研究结果显示，芍药苷、桂皮醛、丹皮酚、苦杏仁苷、香豆素、肉桂酸、苯甲酰芍药苷、茯苓酸、槲皮素、去氢茯苓酸、白芍苷和茯苓多糖12种单体化合物均可以促进脾脏T淋巴细胞的体外增殖转化。而众多文献亦提示，芍药苷、桂皮醛、香豆素、槲皮素和茯苓多糖等可以增强荷瘤小鼠或免疫抑制小鼠的免疫功能，尤其对T细胞介导的细胞免疫具有良好的调节作用[8-12]。在治疗慢性盆腔炎的研究中发现，桂枝茯苓胶囊的活血化瘀和清热解毒可通过抑制前炎症细胞因子、增强抗炎症细胞因子，调节粘连相关的免疫分子，从而抑制炎症反应，缓解粘连，通过免疫调节治疗慢性盆腔炎[13]。
因此，本研究主要从T淋巴细胞的体外增殖转化和T细胞的表面活化信号2个方面，对桂枝茯苓胶囊的免疫调节作用进行了研究。脾脏淋巴细胞的增殖转化实验结果发现桂枝茯苓胶囊与其15个活性组合物可以明显的促进脾淋巴细胞的体外增殖，表明药物对脾脏淋巴细胞活性具有增强作用。对脾脏淋巴细胞的共刺激分子CD80和CD86的结果显示，桂枝茯苓胶囊与其活性组合物可以上调2个分子的表达水平，同时，对T淋巴细胞的活化分子CD25和CD69的表达也具有促进作用。共刺激分子是淋巴细胞被激活后，发生信号转导的关键因子，共刺激分子的表达升高，可有效提高免疫系统发生免疫应答，从而发挥免疫功能的效率。桂枝茯苓胶囊不仅可以有效活化T淋巴细胞，还可以提高CD80和CD86共刺激分子的表达水平，说明桂枝茯苓胶囊与其活性组合物均具有潜在的免疫调节作用，而桂枝茯苓胶囊治疗慢性盆腔炎等疾病的作用机制与药物的免疫调节作用有着很大的关系。
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[责任编辑 马超一]