摘要：为研究保加利亚乳杆菌（LB）N-乙酰胞壁质酶（Mur）的分子生物学特性，根据已发表的保加利亚乳杆菌核苷酸序列，设计并合成一对特异性引物，PCR扩增LB MN株不含跨膜区域序列的mur基因，片段回收后克隆至pMD19-T载体并进行鉴定，再将其亚克隆于原核表达载体pET-30a（+）中构建重组表达质粒pET-30a（+）-mur，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示重组Mur蛋白分子量约为21 kD，能在大肠杆菌中高效表达。
关键词：保加利亚乳杆菌；N-乙酰胞壁质酶；原核表达；鉴定
中图分类号：S879.1：TS252.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）05-0014-04
Abstract In order to study the molecular properties of the N-acetylmuramidase from Lactobacillus bulgaricus， a pair of special primers were designed and synthesized according to the nucleotide sequence of LB mur gene in GenBank. The mur gene without transmembrane sequence was amplified from the genome DNA of LB MN strain and cloned into pMD19-T vector. The gene was sequenced and cloned into the prokaryotic expression vector pET-30a（+）. The recombinant plasmid pET-30a（+）-mur was transformed into competent BL21（DE3） and the expression of the recombinant protein was induced with IPTG. The SDS-PAGE and Western blot showed the molecular weight of the recombinant protein mur was approximately 21 kD and its expression was efficient in Escherichia coli.
Keywords Lactobacillus bulgaricus； N-acetylmuramidase； Prokaryotic expression； Identification
保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）是一种被冠以国姓的乳酸菌，由保加利亚微生物学家Stamen Grigorov在1905年发现并命名。该菌是可用于保健食品的益生菌菌种之一，具有维持微生态平衡和胃肠道健康、促进营养物质的消化和吸收、增强免疫功能及抗癌抗肿瘤等重要生理功能[1，2]。该菌是酸乳发酵剂中的常用菌种，也是酸乳发生后酸化的主要菌株[3]。
有研究表明酸乳货架期菌体自溶影响酸乳的后酸化程度和品质，高自溶活性的保加利亚乳杆菌菌株在酸乳发酵过程中产酸性能更优，酸乳后酸化的程度相对较低[4，5]。而在酸乳发酵剂生产中，保加利亚乳杆菌菌体自溶不利于菌株的高密度培养。菌体自溶与肽聚糖水解酶降解菌体细胞壁的作用息息相关。Pang等报道保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶（N-acetylmuramidase，mur）基因敲除时菌体自溶活性显著降低，该基因过表达时菌体自溶活性显著升高，表明Mur在保加利亚乳杆菌菌体自溶中起着非常重要的作用[6]。本研究构建了保加利亚乳杆菌mur基因的原核表达质粒，在大肠杆菌中进行了诱导表达研究，并应用SDS-PAGE和Western bolt对表达的重组蛋白进行了鉴定，为后续深入研究Mur的自溶活性及开展保加利亚乳杆菌自溶活性的改造研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌株和载体
保加利亚乳杆菌MN株，由本实验室分离、鉴定和保存。原核表达载体pET-30a（+），本实验室保存；pMD19-T克隆载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞和BL21（DE3）感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 主要试剂
Dream Taq DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ为美国Thermo公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；His标签鼠的单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗为Sigma公司产品；His Bind Purification Kit为美国Novagen公司产品。
1.3 引物合成
根据GenBank中保加利亚乳杆菌ATCC 11842（NC_008054.1）基因組序列，应用Primer Premier 5.0设计mur基因的特异引物，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。上游引物：mur-F：5′-GTCATATGCACCATCATCATCATCATCGCCGCCAGGCCTTGC-3′，下游引物：mur-R：5′-CGCAAGCTTTTAATTATCGTACTTATTCAGGTTGTATTGTTC-3′，上下游引物5′端分别引入NdeⅠ和Hind Ⅲ两个酶切位点（下划线处），上游引物5′端还引入了His标签（斜体处）。该引物扩增截掉跨膜区序列的mur基因，预计扩增片段长度为573 bp。
1.4 目的基因克隆
用细菌基因组DNA提取试剂盒提取保加利亚乳杆菌MN株的基因组DNA作为PCR模板，扩增保加利亚乳杆菌mur基因。PCR反应体系：10×buffer 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，Dream Taq DNA Polymerase 0.25 μL，加无菌水至50 μL。PCR 反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，34个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行培养，提取质粒后进行PCR鉴定，将阳性质粒送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
1.5 原核表达载体pET-30a（+）-mur的构建及鉴定
分别用限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切含目的基因的pMD19-T和pET-30a（+）质粒，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的基因和pET-30a（+）线性片段，连接后转化BL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切鉴定，将阳性质粒送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
1.6 重组蛋白的诱导表达
挑取含重组质粒pET-30a（+）-mur的BL21（DE3）单克隆接种于含卡那霉素（Kan）的LB液体培养基上，37℃振荡培养（200 r/min）过夜。取过夜的菌液按1%接种至新鲜的含Kan的LB液体培养基上，37℃振荡培养2～3 h，至菌液OD600值达0.6～0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续振荡培养4 h。分别取诱导前后的菌液离心收集菌体，用PBS（pH值7.4）重悬菌体，加入等量的2×SDS凝胶上样缓冲液，混匀后于沸水中煮10 min，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶）。
1.7 重组蛋白的Western blot 分析
诱导表达的蛋白进行SDS-PAGE后，电转印至PVDF膜上；转印好的PVDF膜用5%脱脂奶粉TBST溶液室温下封闭2 h；TBST漂洗后用His标签鼠的单克隆抗体室温摇床孵育1 h；漂洗后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体室温摇床孵育1 h，最后以DAB显色，观察条带。
2 结果与分析
2.1 目的基因的扩增与鉴定
以保加利亚乳杆菌MN株基因组DNA为模板，成功扩增了不含跨膜区序列的mur基因，琼脂糖凝胶电泳检测可见573 bp的扩增片段，与预期目的基因的片段大小相符（图1）。测序结果显示扩增出的目的基因片段与GenBank上公布的mur基因序列（NC_008054.1）的同源性为99.8%。
2.2 原核表达载体pET-30a（+）-mur的鉴定
挑取PCR鉴定的pET-30a（+）-mur阳性克隆，提取质粒，分别用NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切质粒，pET-30a（+）质粒片段大小约为5 300 bp，mur基因的大小约为570 bp，与预期结果一致（图2）。测序结果显示序列完全正确。
2.3 SDS-PAGE检测
将鉴定阳性的重组表达质粒pET-30a （+）-mur转化BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE，表达产物重组Mur蛋白的相对分子质量约为21 kD（图3）。
2.4 Western blot检测
用His标签鼠的单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠抗体对表达产物进行Western blot分析，结果如图4所示，在硝酸纤维素膜上约21 kD处出现特异性条带。
3 讨论与结论
乳酸菌自溶现象是菌体在胁迫环境下维持生存的一种自我保护行为，大量研究表明肽聚糖水解酶（PGHs）在菌体自溶中发挥着重要作用[7-9]。PGHs按照其作用位点的差异主要分为5类：Mur、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、内肽酶和羧肽酶[10]。不同乳酸菌中所含有的关键PGHs种类存在差异，干酪乳杆菌ATCC 27092和植物乳杆菌WCFS1的關键PGHs是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[11，12]，而保加利亚乳杆菌LJJ的关键PGHs是Mur[6]。
保加利亚乳杆菌Mur可水解肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸间的β-1，4糖苷键，将N-乙酰胞壁酸的还原基团解离出来[13]。前期试验我们构建了完整mur基因的原核表达载体，但IPTG诱导后Mur蛋白几乎不表达。利用SignalP 3.0和TMpred在线软件分析Mur蛋白的氨基酸序列，发现Mur蛋白的5′端存在跨膜区域，因此本研究运用PCR技术扩增了截掉跨膜区序列的mur基因，成功建立了不含跨膜区序列的mur基因的原核表达系统。SDS-PAGE和Western blot分析显示重组Mur蛋白能在大肠杆菌中高效表达。重组mur基因原核表达系统的建立为进一步研究Mur蛋白的分子生物学特性及开展保加利亚乳杆菌自溶活性的改造研究奠定了基础。
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