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[摘要] 目的 研究卡波氏肉瘤病毒（Kaposis"s Sarcoma-Associated Herpesvirus，KSHV）编码的复制转录激活因子（replication and transcription activator，RTA）调控宿主细胞Bcl-2表达的分子机制。 方法 用实时聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）技术检测RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平；采用PCR定点突变和荧光素酶报告基因技术，检测RTA对Bcl-2基因启动子活性的调节，并鉴定启动子序列中对RTA调控具有重要作用的顺式反应元件。 结果 RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高。RTA通过与Bcl-2基因启动子中CCN9GG反应元件结合激活Bcl-2的转录，这种激活作用呈剂量依赖性，并且P2启动子对RTA反式激活Bcl-2基因不可或缺。 结论 KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达，CCN9GG样RTA反应元件和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。
[关键词] 卡波氏肉瘤病毒；复制转录激活因子；Bcl-2；表达上调；启动子活性
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）10（c）-0012-04
卡波氏肉瘤病毒（Kaposis"s Sarcoma-Associated Herpesvirus，KSHV）发现于1994年，又称γ-疱疹病毒8型。该病毒是卡波氏肉瘤（Kaposis"s Sarcoma）、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoa，PEL）、多中心卡氏病（multicentric Castleman"s diease）的病原体[1]。KSHV病毒基因组呈双链DNA，有两种不同的生活周期：潜伏性感染（lantent infection）与裂解性复制（lytic replication）。这两种感染方式存在反馈性调节并可以相互转化[2-3]。在潜伏性感染时，病毒以游离体的形式存在，只表达ORF73、K12、ORF72、ORF71、K15等少数潜伏性基因，有利于建立持久性的感染[4]。在缺氧或TPA诱导等因素作用下病毒呈裂解性感染，以级联反应的形式激活一系列病毒编码基因，并导致宿主细胞的死亡及病毒子的释放，传播至新的宿主细胞[5-6]。
KSHV复制转录激活因子（replication and transcription activator，RTA）是ORF50编码的一种即刻早期蛋白，是促使病毒从潜伏性感染向裂解性感染转变的关键调控因子。无论是外源性还是内源性来源引起的RTA表达增高，均可介导病毒裂解性基因的级联表达[7]。一些化学物质如TPA、butyrate等可诱导KSHV的溶解性感染[8]。KSHV阳性细胞经TPA诱导后1 h就可检出RTA的表达[9]。通过Blast比对，笔者发现抗凋亡基因Bcl-2的P1启动子上游区域含有9个CCN9GG样序列，这里N可以为任何碱基。这些CCN9GG样序列为近年来新发现的RTA反应元件（RTA responsive elements，RREs）[10]。KSHV RTA能否与这些RRE相互作用并调节宿主细胞Bcl-2基因表达？这引起了研究者的极大兴趣。本研究主要探讨KSHV RTA上调宿主Bcl-2的分子机制。
1 材料与方法
1.1 质粒
pcDNA-RTA编码全长RTA的真核表达载体。pGL3-Bcl-2为含Bcl-2基因全长启动子的荧光素酶报告质粒。pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2是采用PCR定点突变技术构建的报告质粒（引物见表1），它们分别突变了Bcl-2基因全长启动子中的9个RRE、启动子P1与启动子P2。构建pGL3-△RREs时，将PCR扩增片段（Bcl-2启动子核苷酸-1563～+1）插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处；构建pGL3-△P2时，将启动子片段（-2744～-680）插入pGL3载体SmaI/HindⅢ双酶切位点处；构建pGL3-△P1时，先将启动子片段（-346～+1）插入pGL3载体MluI/HindⅢ双酶切位点处（pGL3-P2），再将片段（核苷酸-2867～-1545）插入pGL3-P2的MluI/HindⅢ双酶切位点处。
1.2 抗体与细胞
RTA抗体用杂交瘤技术制备，由上海巴斯德研究所蓝柯实验室提供。Bcl-2小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司，GAPDH抗体为Novus Biologicals公司产品，耦联IR Dye 800的羊抗鼠IgG购自Rockland公司。
HEK 293是原代人胚肾细胞转染腺病毒DNA的永生化细胞。BJAB为KSHV和EBVA均阴性的B细胞淋巴瘤细胞系，DG-75为未感染KSHV的Burkitt"s淋巴瘤细胞。BC3和BCBL1是感染KSHV的人体腔淋巴瘤细胞系。细胞培养的方法参见有关文献[11]。
1.3 细胞转染及KSHV的诱导
采用Bio-Rad公司的Gene Pulser电穿孔仪进行细胞转染，电穿孔转染的实验方法在文献中已有介绍[12]。用20 ng/mL TPA、1.5 mM butyrate诱导KSHV，未经诱导处理的细胞作为对照组。所有细胞均在诱导后培养48 h收集。
1.4 Western blot
细胞收集后加入RIPA缓冲液裂解，用Bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞裂解液上样，聚丙烯胺凝胶电泳结束后，转移蛋白样品至PVDF膜，分别用Bcl-2抗体、RTA抗体、GAPDH抗体及耦联IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗进行免疫印迹。用Odyssey红外线成像系统（LI-COR公司）观察结果。
1.5 RT-PCR
TRIzol（Invitrogen）法抽提细胞总RNA，用高容量RNA-to-cDNA试剂盒（Applied Biosystems）逆转录合成cDNA。使用SYBR green实时PCR试剂盒（Applied Biosystems）进行PCR扩增，Bcl-2和GAPDH的引物见表1。10 μL反应体系含5 μL Master Mix，5 μm的引物1 μL，4 μL稀释的cDNA。反应条件为：95℃变性5 min后95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环。每个样品重复3次。数据采集与分析使用StepOnePlus 实时PCR系统（Applied Biosystems）。
1.6 荧光素酶报告基因试验
107个HEK 293细胞、DG75细胞共转染10 μg荧光素酶报告质粒和0、5、10、15、20 μg RTA表达质粒。转染后24 h收获细胞，制备细胞裂解液。向40 μL细胞裂解液中加入25 μL荧光素酶试验底物，使用LmaxⅡ384荧光光度计（Molecular Devices）检测荧光水平。结果以3次试验值的均数与标准差表示。Western blot用来验证转染的蛋白质的表达。
2 结果
2.1 pcDNA-RTA质粒转染HEK 293、DG75细胞后，Bcl-2表达水平上调
pcDNA-RTA质粒转染HEK 293、DG75细胞24 h后，Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高（图1）。HEK 293和DG75细胞瞬时转染不同剂量的RTA表达质粒，抽提细胞总RNA用于RT-PCR分析。结果表明RTA能够上调Bcl-2转录本的水平，而且具有剂量效应关系（图1A）。Western blot也进一步证实RTA能够上调Bcl-2蛋白表达水平（图1B）。
2.2 KSHV阳性的BC3、BCBL1细胞经TPA诱导后，Bcl-2表达水平上调
应用RT-PCR和Western blot对TPA诱导后的BC3、BCBL1细胞Bcl-2表达水平的变化进行检测，结果显示Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平均显著增高（图2）。未经诱导的BC3、BCBL1细胞不表达RTA蛋白，而KSHV阴性的BJAB细胞无论诱导或未诱导均不表达RTA，两者Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平也无差异。
2.3 RTA上调Bcl-2基因启动子活性
为研究RTA对Bcl-2启动子活性的调节作用，HEK 293、DG75 细胞共转染10 μg全长Bcl-2启动子报告质粒和不同剂量的RTA表达质粒，转染后培养24 h收获细胞，制备细胞裂解液，进行荧光素酶报告基因检测。实验结果表明RTA能够特异性地上调Bcl-2基因启动子活性（图3）。当RTA表达质粒转染剂量从5 μg渐增至20 μg时，HEK 293细胞的Bcl-2启动子活性增加12～35倍（图3A）；DG75细胞Bcl-2启动子活性增加5～25倍（图3B）。
2.4 P2启动子和CCN9GG样序列对RTA上调Bcl-2启动子活性具有重要作用
Bcl-2基因人有两个启动子，分别称为启动子1（promoter1，P1）和启动子2（promoter2，P2）。P1位于起始密码子上游约1.4kb处，没有典型的TATA盒，富含能被Sp-1结合的GC盒。P2位于起始密码子上游约80bp处，具有典型的CCAAT盒和TATA盒。在P1上游距起始密码子1.6～2.6 kb处有9个CCN9GG样RTA反应元件（图4A）。为定位Bcl-2全长启动子中对RTA调控具有重要作用的顺式反应元件，应用PCR定点突变技术构建了3个截短的报告质粒，命名为：pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2。它们分别突变了9个CCN9GG样序列、P1和P2启动子。
荧光素酶报告基因检测显示，突变P1启动子对共转染了pcDNA-RTA和pGL3-△P1报告质粒的HEK 293、DG75细胞启动子活性并无影响（图4B、C），与全长启动子的活性相似（图3）。一旦突变P2启动子或9个CCN9GG样RREs，均导致共转染了pcDNA-RTA和报告质粒的HEK 293、DG75细胞启动子活性几乎完全关闭，与只转染报告质粒而无RTA表达时启动子活性相似（图4B、C）。上述结果充分说明P2启动子和9个CCN9GG样RREs对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。
3 讨论
病毒感染与细胞凋亡有密切的联系。感染细胞的凋亡可以限制病毒的复制，是机体一种抗病毒的防御机制。相应地，病毒为了在宿主体内长期生存，可通过多种途径干扰机体介导的感染细胞的凋亡，以利于病毒自身的生存与扩散[13-14]。Bcl-2蛋白是一种定位于线粒体上的膜蛋白，为Bcl-2原癌基因所编码，具有抑制细胞凋亡的功能[15-16]。Bcl-2基因在许多肿瘤细胞都高表达，不仅阻止肿瘤细胞凋亡，而且是肿瘤化疗、放疗不敏感的重要原因[17]。本研究证实KSHV RTA上调宿主细胞Bcl-2表达。在RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高。RTA可直接激活Bcl-2基因启动子，这种激活作用呈剂量依赖性，无细胞选择性。
为阐明RTA调控Bcl-2的分子机制，对Bcl-2基因启动子中的作用元件进行了鉴定。通过Blast比对发现Bcl-2的P1启动子上游区域含有9个CCN9GG样序列。这种CCN9GG样序列为近年来新发现的RTA作用元件，存在于KSHV的5个基因ORF57、K2、PAN、MIP和K12启动子中[10]。它在体外与体内都与RTA相互作用，并调节RTA的反式激活[10]。RTA可能通过与Bcl-2基因启动子中的CCN9GG样RRE相互作用上调其表达。荧光素酶报告基因检测显示，采用定点PCR突变技术突变Bcl-2基因启动子的9个CCN9GG样RRE，导致启动子活性完全关闭。因此可以认为CCN9GG样RRE对RTA介导的Bcl-2调控具有重要的作用。EBV RRE序列GNCCN9GGNG与KSHV RRE具有高度的一致性[18]，另一项有关EBV RRE的研究指出，由于N9的碱基变化，CCN9GG样RRE对RTA调控基因的转录、病毒的激活存在反应性差异[19]。KSHV亦是如此，PAN的RRE与RTA的相互作用强于K2、K12的RRE[20]。一些转录因子的结合位点在CCN9GG样RRE附近，它们可与RTA间接结合发挥调控作用。RTA既可与CCN9GG样RRE结合，也可与已经结合到顺式作用元件的转录因子形成复合物，发挥对靶基因启动子活性的最佳调节。
P2启动子为RTA调控Bcl-2所必需。突变P1后启动子活性并无降低，与Bcl-2全长启动子的活性相似；而突变P2会导致启动子活性显著降低。P2启动子具有典型的CCAAT盒和TATA盒；P1启动子富含能被Sp-1结合的GC盒，没有典型的TATA盒[21]。这可能是RTA介导的Bcl-2表达上调对P2启动子具有选择性的原因。
综上所述，KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达，CCN9GG样RTA反应元件和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。KSHV RTA介导的Bcl-2表达上调在宿主细胞增殖与凋亡、病毒子的产生等方面的生物学意义将在后续的研究报告中述及。
致谢：衷心感谢Véronique Bourgarel-Rey（Aix-Marseille Université，Marseille Cedex 05，France）提供Bcl-2基因全长启动子荧光素酶报告质粒pGL3-Bcl-2。E.S.R.是美国白血病和淋巴瘤学会的会员。
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（收稿日期：2012-09-14 本文编辑：郭静娟）