摘要禽流感(AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的禽类烈性传染病。它不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。因此,禽流感已经成为人们关注的焦点。从病原基因组及其编码的蛋白质、致病力、变异性以及对AIV的分子诊断等角度就AIV的分子生物学研究进行综述,为防治AI提供理论基础。
关键词禽流感病毒;基因组;变异性;分子诊断;研究进展
中图分类号 R51 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0216-02
禽流感(Avian influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性传染病,国际兽疫局(OIE)把该病定为A类烈性传染病。禽流感病毒(Avian influenza vi- rus,AIV)典型的病毒粒子为球形,直径80～120nm,有时呈丝状体等多形态,至今A型流感病毒的血凝素已发现有16种,神经氨酸酶有10种。其血清型较多,容易变异。常发生在禽,有时也发生在低等哺乳类动物,至今在人仅有偶发病例。禽流感病毒根据其对鸡致病性的不同分为高致病性、中致病性和低/非致病性。禽流感病毒不仅会给养禽、畜牧业带来灾难性的破坏,而且对公共健康也构成了严重威胁。
1AIV基因组及其编码蛋白的功能
1.1AIV基因组
AIV基因组为单股负链RNA,共有8个独立的RNA节段。通过对某些毒株8个节段的测序,发现它们存在一些共同的特点,即所有基因节段的5′端前13个核苷酸均相同,3′端也有12个高度保守的核苷酸,另外在每一节段靠近5′端15～21位核苷酸处有一保守区。其序列为PolyU。这一序列可以在病毒mRNA合成时产生PolyA。
1.2病毒的蛋白
1.2.1血凝素(Hem agglutinin,HA)。HA是流感病毒囊膜纤突的主要成分之一,是基因表达产物中最大的糖蛋白,为诱生保护性免疫的主要抗原,HA在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用,刺激机体产生的中和抗体,可中和病毒的感染力,抵抗病毒的感染和发病。它是A型流感病毒毒力的主要决定因素。
1.2.2神经氨酸酶(Heuram in idase,NA)。NA由病毒核糖核酸(vRNA)片段6编码,是另一个主要的表面抗原,其成熟的形式是具有催化活性的四聚体,能将唾液酸从糖蛋白和糖脂中切开。其作用是水解细胞表面的特异性糖蛋白末端的N—乙酰基神经氨酸。避免病毒粒子的聚集,有利于病毒的释放,对病毒在感染细胞周围的扩散能力有很大影响。
1.2.3核蛋白(Nucleo protein,NP)。NP是由片段5编码的结构蛋白。主要功能是使病毒RNA(vRNA)形成核糖核蛋白复合体,以此来稳定vRNA,使其免受核糖核酸作用。另外,NP在病毒基因组的转录和复制以及决定病毒的宿主特异性方面都有重要的作用,而且它是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。
1.2.4基质蛋白(Matrix protein,MP)。第7节段RNA编码的蛋白被称为M1,部分分子量较小的蛋白称为M2。M1构成病毒的基质膜,具有型特异性,其抗原性的差异也是流感病毒分型的依据之一。另外,M1在子代病毒粒子的装配方面也有一定的作用。M2是一种跨膜蛋白,其作用是在HA合成过程中作为离子通道控制高尔基体内的pH值,在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境。
1.2.5聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA)。A型流感病毒的聚合酶蛋白由PB1、PB2、PA等3种成分组成。这3种蛋白质的共同特点是含有一特异的亲核序列区,其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。其中,PB2、PB1与合成互补RNA有关,而PA、核蛋白与病毒的RNA合成有关。
1.2.6非结构蛋白(Non-structural proteins,NS)。A型流感病毒的结构蛋白由片段8编码。片段8也有2个编码框,可编码2种蛋白质即NS1和NS2。NS1和NS2 两种非结构蛋白的编码区是基因组中最小的RNA片段。NS1和NS2相互间有70个氮基酸重叠,分别由不同的mRNA翻译,提示它们由不同读码框架翻译。在早期感染中NS1合成并在细胞核内积聚,磷酸化的NS1蛋白在病毒的复制过程中起调节作用;NS2主要在晚期感染中出现,并主要在胞浆中存在,目前它的功能还没有彻底搞清。
1.2.7其他蛋白质(HE、M3、NB)。由基因节段7编码,明确的功能还不清楚。
1.3AIV毒力变异的分子基础
AIV很容易发生变异,诱发AIV发生变异的主要机理有抗原性变异,即抗原漂移(Antigenic Drift)和抗原转变(Antigenic Shift)。在甲型流感病毒中,抗原漂移主要是由HA或NA基因发生点突变引起的,其中HA基因的变异率最高。每个核苷酸在每个复制周期中的变异率可高达2.0%。一般认为,来自宿主的免疫压力是HA和NA抗原漂移的主要原因。由于突变幅度较大或各节段RNA间发生的重排导致抗原性发生大转变导致新病毒亚型的产生,这种变异称为抗原转变。大量试验证明,不同亚型病毒同时感染1个细胞时,病毒基因组可发生节段间的交换。理论上讲,8个RNA片段存在256个不同的组合方式。事实证明,在自然界中经常有混合感染导致基因重组的事件发生。
2AIV的分子诊断
2.1血清学诊断技术
血清学诊断技术是从禽类体内采集血液析出血清后,检测血清中抗体的有无和滴度变化,如琼脂凝胶扩散试验(AGID)、细胞凝集抑制试验(HI)。AGP试验鉴定病毒或检测特异性的血清抗体或基质蛋白MP(Matrix protein)、特异性核蛋白NP。血细胞凝集试验(HA)和血细胞凝集抑制试验(HIT)鉴定病毒或血清抗体的亚型,神经氨酸酶抑制试验(NI)鉴定病毒或血清抗体亚型等。
2.2RT-PCR分子诊断技术
崔尚金等(1998)建立了一种能够直接检测禽粪和鸡胚尿囊液中H亚型禽流感病毒RNA的RT-PCR检测方法。检测过程仅需8h,不仅具有高度的敏感性和特异性,还可大大缩短对禽流感病毒的检出时间。而应用毛细管PCR(15 min,30个循环)代替常规PCR(2.5h,30个循环)进一步缩短检测时间的研究也已展开。并进入更深层次的领域,以期用于不同样品的检测,使该方法更加适用于禽流感病毒的临床早期诊断。该技术在特异地检出H或H亚型禽流感病毒同时,还可根据应用特定引物经RT-PCR扩增出的H和H包括裂解位点在内的HA基因片段。经测序推导出的氨基酸序列,判断H或H亚型禽流感病毒的致病性高低。
2.3酶免疫测定(EIA)技术
EIA技术在AI的诊断与监测方面已被广泛采用。Doller等建立了一种从鼻咽分泌物中直接检测流感病毒抗原的酶免疫方法,该方法无须对病料进行超声处理,而且在4h即可出结果。Cherian等建立了一种用于检测呼吸道分泌物中A型流感病毒RNA的PCR酶免疫(PCREIA)方法。该方法对感染后4d的病料A型AIV的检测特别有效。Schweiger等建立了用于检测A型AIVN1和N2型的DNA酶免疫(DEIA)方法。该方法简单、快速,可进行大批样品的检测。
2.4荧光PCR法
荧光RT-PCR技术是20世纪90年代末发展起来的新技术,将荧光素标记的探针与引物一起,在荧光PCR仪中反应,电脑对整个反应进行实时监测,避免了交叉污染,提高了检测敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原体、艾滋病病毒等的检测,根据A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计引物、探针,建立的通用型荧光RT-PCR检测方法不仅能够用来检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型,而且对其他禽流感病毒亚型也能检出。用通用型探针、引物检测常见其他禽类病毒,未发现交叉反应。说明该方法敏感性高、特异性强。
2.5核酸探针技术
核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一,是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具。用PCR技术制备了核蛋白基因片段(NPC)的地高辛标记cDNA探针,建立并优化了检测AIV的探针杂交法。该探针具有较好的特异性和敏感性,为从分子水平探讨禽流感的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的诊断技术进行了研究,结果表明,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。
3结论
禽流感是一种全球性的烈性传染病,可在宿主中不断发生变异和基因重组,是2l世纪我国养禽业将面临的最大的瘟疫性威胁。禽流感可在禽、猪和人中进行传播。AIV不仅作为人流感的最大基因库而间接威胁人类健康,而且还可作为人类的新病毒而直接构成人类的威胁。因此,预防禽流感具有重要的公共卫生意义和经济意义。随着现代分子生物学、微生物学、免疫学等学科的发展,以及同其他学科间的渗透,禽流感的传统检测诊断技术将与现代分子生物学技术结合或者现代分子生物学技术与其他学科研究技术有机结合,一定会实现诊断的快捷、方便、准确、灵敏、经济、易操作,为禽流感的防治做出重大贡献。
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