摘要：植物瞬时表达系统常用于研究基因表达产物的亚细胞定位和蛋白间的互作，将GFP-GUS融合蛋白植物表达载体导入农杆菌EHA105，获得工程菌，制备不同浓度的农杆菌浸染液，用注射法对烟草叶片进行转化，荧光显微镜检测烟草叶片原生质体和下表皮中GFP的表达情况。结果表明，浸染注射液的D600 nm 在0.3～0.7之间均具有较高的转化效率，注射后第4天至第6天为较佳观察时间。
关键词：植物瞬时表达系统；渗透法；转化；农杆菌渗透注射；烟草；绿色荧光蛋白（GFP）
中图分类号： S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0045-03
收稿日期：2013-11-25
基金项目：临沧师范高等专科学校高层次人才引进科研启动项目（编号：LXJ2012）；临沧师范高等专科学校校级课题（编号：LCSZL2013001 ）
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作者简介：李晓君（1985—），女，云南临沧人，博士，讲师，主要从事植物生物技术与种质创新研究。E-mail：lxj-148@163.com。植物瞬时表达系统常用于基因产物的亚细胞定位、蛋白间互作、转录因子与启动子之间的互作、启动子分析等方面的研究[1-2]。植物瞬时表达系统中外源基因的导入方法有植物病毒介导法、PEG法、电击法、基因枪法和农杆菌渗透法[2]。农杆菌渗透法是一种比较简便的方法，通过将植物表达载体导入农杆菌，用真空法或注射法将农杆菌导入植物细胞，使得农杆菌Ti质粒上的T-DNA区整合到植物基因组中，T-DNA 区的目标基因培养几天后即可得到表达[3]。较其他方法而言，农杆菌渗透法具有转化效率高、基因表达在完整活体内进行、可携带较大片段的目的基因等优点[2]。原生质体是观察基因瞬时表达情况的优选材料，传统的原生质体转化方法首先要制备高浓度、高质量的质粒，经过从植物活体材料中分离纯化原生质体，在PEG的介导下将质粒DNA导入原生质体，进行原生质体培养后再检测目标基因的表达情况[4]。用该方法转化后的原生质体敏感、易破裂，使得阳性细胞检出率低，不利于观察。以农杆菌渗透法转化材料提取原生质体，可缩短从原生质体提取到观察的时间，原生质体完整，镜检阳性率高。本研究在Sparke等的研究基础[5]上简化了农杆菌注射液的制备和注射过程，通过荧光显微镜观察注射区域下表皮和原生质体中绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，检测不同注射浓度下和注射后不同时间的转化效率，总结出一种高效简易的农杆菌渗透注射转化烟草的方法。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1植物材料将普通烟草（Nicotiana tabacum）种子播撒在育苗盘中，2周后移至小花盆，5～6周后即可作为转化受体。
1.1.2菌种和质粒农杆菌EHA105为临沧师范高等专科学校农学系植物生理实验室保存，植物表达载体pCAMBIA1304图谱如图1（空载体表达GFP-GUS基因，亚细胞定位特点：细胞质[6]）所示。
1.1.3试验仪器和用具低温高速离心机（MIKR V22R，HETTICH）、摇床（G-27，EKISO）、荧光显微镜（TCS-SP5LEICA）、5 mL 一次性注射器[生工生物工程（上海）
股份有限公司]、低温冰箱（海尔）。
1.2试剂配制
本试验所用药品及试剂均为国产分析纯。（1）母液6种。包括0.2 mol/L MES（2-N-吗啉代乙磺酸）、0.8 mol/L 甘露醇、1 mol/L CaCl2、2 mol/L KCl、1 mol/L乙酰丁香酮、1 mol/L Na3PO4·12H2O。除了甘露醇母液外，其他均4 ℃保存。（2）YEB液体培养基。包括10 g/L酵母膏、5 g/L蛋白胨、5 g/L蔗糖、1 g/L MgSO4。121 ℃灭菌25 min，冷却，加入3种抗生素（终浓度10 mg/L 卡那霉素、25 mg/L链霉素、50 mg/L 利福平），4 ℃保存。（3）注射培养基。包括10 g/L D-果糖、50 mmol/L MES、10 mmol/L CaCl2、2 mmol/L Na3PO4·12H2O、0.1 mmol/L 乙酰丁香酮，现用现配。（4）原生质体提取溶液Ⅰ。包括15 mg/mL 纤维素酶、5 mg/mL 离析酶、20 mmol/L MES、400 mmol/L 甘露醇、20 mmol/L KCl，现用现配。（5）原生质体提取溶液Ⅱ。包括5 mL 1 mol/L CaCl2、5 mL 10% BSA、1 mL β-ME，现配现用，配制后用 0.45 μm 滤头过滤。（6）W5溶液。包括 2 mmol/L MES、154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5mmol/L KCl，可提前配制，4 ℃保存。（7）MMG溶液。包括400 mmol/L 甘露醇、15 mmol/L MgCl2、4 mmol/L MES，可提前配制，4 ℃保存。
1.3农杆菌渗透注射法转化烟草
1.3.1工程菌的获得和活化用冻融法将pCAMBIA1304质粒转入农杆菌EHA105感受态细胞，获得工程菌株，低温保存。将10 μL工程菌种接入5 mL的YEB液体培养基（含 10 mg/L 卡那霉素、25 mg/L链霉素、50 mg/L 利福平） 中活化12 h（28 ℃，200 r/min）。
1.3.2注射液的准备菌体活化后，按照1 ∶100的体积比进行转摇（28 ℃，200 r/min），培养5～6 h，离心，收集菌体（室温、1 000 g、10 min），加入1/2菌液体积的注射培养基进行重悬，室温下1 000 g离心10 min，弃上清，重复1次，去除残留的抗生素；将菌体用注射培养基进行重悬，用注射培养基稀释菌体至7个浓度，其对应的D600 nm为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5，此时配制得菌体注射液，此注射液可室温放置4～5 h，也可立即使用。
1.3.3注射法转化注射前将烟草在日光灯下培养2～3 h，以便烟草气孔张开而有利于注射。选择烟草植株中部较大的2张叶片进行注射，先用去掉针头的注射器轻轻擦除无主脉处的下表皮蜡质，形成注射点；用无针头的注射器吸取0.5～1.0 mL的菌体注射液，左手扶着注射叶片正面，右手将菌体注射液由注射点轻轻地推入，每个点注射量以注射液无法在叶背面扩散为止，每个叶片注射不超过4个点，每个浓度的注射液注射5个植株。注射后，用标记笔标记注射液扩散的范围。为了防止操作失误引起的注射液喷射，在注射的过程中要带口罩、手套和眼镜。如果同时进行多个工程菌的注射，在注射不同的菌前更换1次手套，防止交叉污染。注射完后，将烟草放置于培养箱中，如果天气晴朗，也可直接置于大棚内培养，隔天浇1次水。
1.4显微观察目标蛋白表达情况
由于pCAMBIA1304表达的为GUS-GFP融合基因，因此可以通过GUS染色和荧光显微观察2种途径进行目的蛋白表达的检测。本研究通过荧光显微观察方法进行GFP蛋白表达的检测。（1）直接观察法。注射后第2天开始，每天撕取一小片（1 cm2左右）的注射液扩散范围的烟草下表皮，放在载玻片上（滴水），盖上盖玻片，用荧光显微镜进行观察，连续观察7 d，检测阳性细胞的比例。（2）原生质体观察法。转化后第4天，收集各个菌液浓度处理的3个植株叶片，每个植株取1.5 cm2左右，混样提取原生质体。原生质体提取参照RAO等的方法[7]，先根据样品配制提取溶液Ⅰ（每份样品5 mL），将提取酶液溶液Ⅰ在55 ℃下温育10 min，冷却后加入提取溶液Ⅱ（每份样品110 μL）；将叶片切成1 mm宽的细条，放入酶液Ⅰ和酶液Ⅱ的混合液中，用镊子打散；抽真空 20 min 后消化3 h，摇匀，在裂解液中加入W5溶液稀释（每份样品5 mL），用300目钢网过滤杂质和碎片。将滤液吸入 2 mL 离心管中，100 g离心2 min后小心将离心管置于冰上15 min，去上清，加入MMG溶液调整各个样品的原生质体浓度至基本一致，约100 万个/mL。用荧光显微镜进行检测各个样品的阳性细胞比例，统计3个10倍镜视野下的阳性细胞占正常原生质体的比例，在明场下检测完整原生质体占视野中总原生质体的比例，以未注射的烟草作为以上2个观察试验的空白对照。
2结果与分析
2.1转化烟草下表皮观察
转化后第2天开始，每天撕取不同浓度菌液注射后的烟草植株叶片的下表皮用荧光显微观察GFP的表达情况，由表1可见，除了D600 nm 为0.1的注射样品外，在注射后第3天均可在烟草叶片下表皮中观察到绿色荧光，而注射浓度D600 nm为0.3～07之间的注射样品在第4天和第7天均可检测到较强的绿色荧光。菌液浓度D600 nm>0.9时会降低转化效率；注射液D600 nm为0.5时，GFP的表达强度在第4天至第6天最好。
2.2菌液注射浓度对转化效率和原生质体成活率的影响
转化后第4天，提取不同浓度菌液注射后的烟草叶片原生质体进行观察，对GFP阳性细胞的比率进行统计，并在明场下统计破损原生质体的比例，结果如图2所示。当D600 nm为0.1或大于0.9时，阳性细胞的检出率均低于20%；而在0.3～07 之间时，阳性细胞检出率均在30%以上；0.5则为最佳转化浓度，转化率达45%，原生质体较为完整，转化效率较高。随着注射浓度的增加，菌液对叶片细胞的伤害增强，当D600 nm>0.9时，提取的原生质体成活率降低至60%以下。图3为转化后第4天注射菌液浓度D600 nm为0.5时注射区域烟草下表皮和原生质体中GFP的表达情况。
3结论
农杆菌介导转化烟草的瞬时表达常常通过离体渗透法，也可通过注射法进行[8-9]。本研究所用的农杆菌渗透转化法在转化过程中只需配制菌体培养液和注射液，注射液现配现用，比较方便快捷。通过荧光显微镜在细胞水平对转化效率进行分析，并分析注射液浓度对原生质体成活率的影响，结果表明注射液的浓度对试验结果有重要影响，注射液浓度D600 nm 为0.3～0.7时均能得到理想的结果，在第4天至第6天时进行检测最为合适。在亚细胞定位研究中，利用 X-GFP-GUS 融合蛋白表达系统，其优点是在检测目标蛋白的表达时，既可以通过GUS染色的方法观察目的基因在植物不同组织和不同发育时期的表达情况，也可以直接通过显微观察细胞中的GFP荧光信号分析目的基因的亚细胞定位和蛋白互作情况；且X-GFP-GUS融合蛋白分子量较大，可以防止融合蛋白自由扩散，对于目的蛋白分子量较小的基因可以减少定位误差[10]。
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