摘要：肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齒报春苣苔（Primulina spinulosa）转录组测序数据，获得（鉴定）1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明，该基因全长1 347 bp（GenBank登录号为MG521418），开放阅读框（ORF）为1 008 bp，共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明，该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku，理论等电点为5.09，为亲水性蛋白，含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，FJ222452）的相似性高达90%，两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。
关键词：刺齿报春苣苔;肌醇半乳糖苷合成酶基因;基因序列分析;信号肽
中图分类号： S184文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）08-0056-04
肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，简称GolS）是糖基转移酶家族的一个亚家族，能催化半乳糖和肌醇反应合成肌醇半乳糖苷，为棉子糖系列寡糖的合成提供半乳糖基。棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，简称RFOs）主要包括棉子糖、水苏糖、毛蕊草糖等，是高等植物中重要的可溶性小分子渗透调节物质[1]。当植物受到环境胁迫时，可以快速合成并积累不同种类的渗透调节物质来维持植物细胞内正常的生理机能，调节植物以适应环境胁迫，使植物免受胁迫伤害。一些体内不含棉子糖系列寡糖或其含量极低的植物，在受到干旱、高盐和低温等逆境胁迫后，棉子糖系列寡糖会迅速积累，植株的抗逆性也随之增强。
肌醇半乳糖苷合成酶是植物体内棉子糖系列寡糖合成起始的关键酶，调控着植物体内棉子糖系列寡糖的积累[2]。目前已有研究表明，GolS基因在一些植物受到逆境胁迫后表达量上升，从而参与响应逆境胁迫，如水稻（Oryza sativa）2个GolS基因在干旱、盐处理下的表达量大幅度上调，其中1个还可以积极响应冷胁迫[3]。目前研究者已经从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中分离出7个GolS基因，其中AtGolS1、AtGolS2由干旱、盐胁迫诱导，AtGolS2基因在拟南芥中的超表达提高了肌醇半乳糖苷、棉子糖的含量，并增强了植物的抗旱能力，而AtGolS3受到低温胁迫诱导[4-5]。咖啡（Coffea arabica）中有3个GolS类基因，CaGolS2的表达量在干旱、盐胁迫下上调，CaGolS3的表达量在干旱胁迫下上调，而CaGolS1能够参与调控植物响应干旱、低温及盐胁迫[6]。在杨树（Populus）的9个GolS基因中，PtrGolS2、PtrGolS8受到低温胁迫的诱导，PtrGolS3、PtrGolS4和PtrGolS6受到盐胁迫的诱导，而所有PtrGolS基因都参与到杨树植株对干旱胁迫的应答中[7-8]。木薯（Manihot esculenta）中有7个GolS类基因，其中MeGolS1、MeGolS5受到干旱诱导，表达量明显上调，能更迅速地积极响应干旱胁迫[9]。在甘蓝型油菜[10-11]、小盐芥[12]和日本黄连[13]等植物中也存在类似的生理现象。可见GolS基因在植物抵抗干旱、寒冷等逆境胁迫中起到重要作用。
刺齿报春苣苔（Primulina spinulosa）是苦苣苔科（Gesneriaceae）报春苣苔属多年生草本植物，其叶肉质多汁，为我国广西西南部所特有。目前，关于刺齿报春苣苔的报道甚少，主要研究集中在其离体快速繁殖方面[14]，而对其功能基因的研究未见报道。报春苣苔属植物一般生长于阴湿的石灰岩岩壁上或洞穴中，而刺齿报春苣苔则生长在阳光直射、光秃裸露的石灰岩缝隙中，属于极端的耐旱种类。为了探讨刺齿报春苣苔的耐旱机制，笔者对刺齿报春苣苔进行了转录组测序，通过同源序列搜索（BLAST）筛选获得了刺齿报春苣苔的GolS基因序列，并对该基因序列及其编码的蛋白质进行了分析，旨在为刺齿报春苣苔耐旱分子机制的研究提供参考。
1材料与方法
1.1材料
刺齿报春苣苔试验材料采自广西扶绥县渠黎镇。采集同一居群的3～5个个体的顶端嫩叶（长度<1 cm），采后迅速将其放入液氮中速冻保存。
1.2方法
1.2.1RNA的提取、建库和测序用改良的TRIzol法对总RNA进行提取[15]，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司对检测合格的RNA进行建库和测序。用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，随后加入fragmentation buffer（片断化缓冲液）将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（randomhexamers）合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ（DNA聚合酶Ⅰ）、RNase H（核糖核酸酶H）合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA。将纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小的选择，最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成后，先用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1.5 ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的insert size（插入片段大小）进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR（定量PCR）方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库的有效浓度应>2 nmol/L），以保证文库质量。最后用IlluminaHiSeqTM 2500对制备好的文库进行测序。
1.2.2序列分析和系统树构建在GenBank公共数据库中下载苦苣苔科旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）的GolS基因（登錄号：FJ222452），使用Bioedit中的local BLAST功能，以测序获得的刺齿报春苣苔转录组为搜索库，找出刺齿报春苣苔的GolS类基因。用DNAman、Finder、TMPRED、SWISS-MODEL、NetPhos 2.0、SignaIP 4.1等软件进行序列的开放阅读框（ORF）、编码氨基酸、编码蛋白的理化性质分析。将筛选到的刺齿报春苣苔GolS基因序列在GenBank中进行BLAST搜索，找到与之高度相似的同源序列，并下载11种植物的同源序列，基于该基因翻译的氨基酸序列，用DNAman软件进行系统发育树的构建，构建方法参考文献[16]。
2结果与分析
2.1基因的生物信息学分析
在本研究测序获得的P. spinulosa转录组数据库中（测序深度约为6G），笔者只筛选到1个GolS基因，该基因序列全长1 347 bp（GenBank登录号为MG521418），使用美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站上的NCBI ORF Finder和生物信息学软件DNAman对该基因序列进行分析，结果表明，该序列包含1个1 008 bp的开放阅读框，编码335个氨基酸。
2.2编码蛋白质的分析和疏水性预测
通过DNAman软件分析得出，本研究中GolS基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku， 等电点（pI）为5.09。从蛋白质序列的疏水性分析结果可以看出，GolS基因编码的肽链中疏水值最大约为3.66，最小值约为-2.86，平均值是-0.18，属于亲水性蛋白。
用在线分析软件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）进行分析可知，该蛋白质带负电荷的氨基酸[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]总数为41个，带正电荷的氨基酸[精氨酸（Arg）+赖氨酸（Lys）]总数为29个，分子式为C1 733H2 618N434O498S17，不稳定系数为 36.65，属于稳定性蛋白质。
2.3功能结构域的分析
将编码的氨基酸序列用NCBI的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool进行分析，发现该蛋白质具有1个与糖基转移酶家族（glycosyltransferases superfamily）蛋白相同的保守活性位点[JP3]（conserved active sites，简称CAS）结构域。
2.4跨膜预测
用跨膜蛋白数据库TMbase（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form. html）预测GolS蛋白的跨膜区域。从可以看出，该蛋白不存在跨膜结构蛋白，为膜内蛋白。
2.5蛋白质的磷酸化预测
通过在线蛋白磷酸化位点分析软件NetPhos 2.0 Server对GolS基因编码的蛋白进行预测，结果表明，该多肽链中预测分值在0.5以上的可能的磷酸化位点共有13个。其中，丝氨酸（Ser）可能的磷酸化位点共有3个，分别位于肽链的18、22、203位;苏氨酸（Thr）可能的磷酸化位点共有3个，分别位于肽链的218、276、335位;酪氨酸（Tyr）可能的磷酸化位点共有7个，分别位于肽链的42、105、125、190、205、234、298位。
2.6糖基化位点和信号肽的分析
采用NetNGlyc 1.0对GolS基因编码的氨基酸序列进行分析，发现有2个潜在的N-糖基化位点，但是糖基化一般发生在信号受体蛋白分子上，而用SignaIP 4.1软件预测结果显示其没有信号肽，说明在体内这些预测的潜在的N-糖基化位点可能不能真正地被糖基化。
2.7蛋白质的二级结构及三级结构预测
用SOPMA软件对GolS蛋白的二级结构进行预测，如图6所示，α-螺旋约占37.91%，延伸直链约占23.58%，β-转角约占10.15%，无规则卷曲约占28.36%，其中α-螺旋为主要结构。
利用SWISS-Model对刺齿报春苣苔GolS蛋白的三级结构进行预测，结果表明，GolS蛋白的三级结构含有8个α-螺旋，6个β-折叠，其间由无规则卷曲连接。
2.8系统发育分析
刺齿报春苣苔GolS基因编码的氨基酸与旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，登录号：FJ222452）GolS基因编码的氨基酸序列的相似性为90%，在系统树上聚为1支。
3讨论
已有报道显示，旋蒴苣苔中的GolS基因响应干旱胁迫，旋蒴苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因BhGolS1的启动子上含有4个与WRKY转录因子特异结合的顺式作用元件W-box，已证实该元件是旋蒴苣苔响应干旱胁迫的关键因子[17]。在对旋蒴苣苔的研究中发现，WRKY转录因子是通过ABA（脱落酸）信号转导途径来调控BhGolS1的表达以响应干旱胁迫的，而[CM（25]且拟南芥中的AtGolS1、AtGolS2[4]和毛果杨中的PtrGolS2、PtrGolS5-7[8]均被证明是受ABA诱导的。本研究通过转录组测序获得的刺齿报春苣苔GolS基因和已知的与抗旱相关的旋蒴苣苔GolS基因的相似性很高，推测其可能在刺齿报春苣苔耐旱过程中起重要作用，但是其作用机制是否与旋蒴苣苔相似，也受到转录因子WRKY的调控，因此可见参与ABA依赖的信号转导途径需要深入研究。另外，有研究发现，拟南芥中的GolS基因受到了2类转录因子的调控，热激因子（HSFs）可以激活AtGolS1的表达[18]，DREB1A/CBF3可以激活AtGolS3的表达和增强抗旱耐冻性[4]。至于刺齿报春苣苔的GolS基因否也受到不同转录因子的调控，其具体机制还有待进一步研究。
参考文献：
[1]李芳，汪晓峰. 植物中棉子糖系列寡糖代谢及其调控关键酶研究进展[J]. 西北植物学报，2008，28（4）：852-859.
[2]Keller F，Pharr D M. Metabolism of carbohydrates in sinks and sources：galactosyl-sucrose oligosaccharides[M]//Photoassimilate Distribution in Plants and Crops：Source-Sink Relationships. New York：Marcel Dekker，1996：157-183.
[3]Sengupta S，Mukherjee S，Parween S，et al. Galactinol synthase across evolutionary diverse taxa：functional preference for higher plants？[J]. FEBS Letters，2012，586（10）：1488-1496.
[4]Taji T，Ohsumi C，Iuchi S，et al. Important roles of drought‐and cold‐inducible genes for galactinol synthase in stress tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2002，29（4）：417-426.
[5]Nishizawa A，Yabuta Y，Shigeoka S. Galactinol and raffinose constitute a novel function to protect plants from oxidative damage[J]. Plant physiology，2008，147（3）：1251-1263.
[6]Dos Santos T B，Budzinski I G F，Marur C J，et al. Expression of three galactinol synthase isoforms in Coffeaarabica L. and accumulation of raffinose and stachyose in response to abiotic stresses[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（4）：441-448.
[7]Unda F，Canam T，Preston L，et al. Isolation and characterization of galactinol synthases from hybrid poplar[J]. Journal of experimental botany，2011，63（5）：2059-2069.
[8]Zhou J，Yang Y，Yu J，et al. Responses of Populus trichocarpa galactinol synthase genes to abiotic stresses[J]. Journal of plant research，2014，127（2）：347-358.
[9]范潔. 木薯肌醇半乳糖苷合成酶基因MeGolS5的抗旱功能研究[D]. 海南：海南大学，2015：46-49.
[10]卓加金. 油菜GolS基因的克隆、表达分析及种子脱水耐性的研究[D]. 北京：北京林业大学，2009：17-34.
[11]Li X，Zhuo J J，Jing Y，et al. Expression of a GALACTINOL SYNTHASE gene is positively associated with desiccation tolerance of Brassica napus seeds during development[J]. Journal of plant physiology，2011，168（15）：1761-1770.
[12]Wang Z I，Li P H，Fredricksen M，et al. Expressed sequence tags from Thellungiella halophila，a new model to study plant salt-tolerance[J]. Plant Science，2004，166（3）：609-616.
[13]Takanashi K，Shitan N，Sugiyama A，et al. Galactinol synthase gene of Coptis japonica is involved in berberinetolerance[J]. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2008，72（2）：398-405.
[14]汤正辉，陈维伦，石雷，等. 刺齿报春苣苔苣苔的离体快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，2004，40（2）：211.
[15]Bariola P A，Howard C J，Taylor C B，et al. The Arabidopsis thaliana ribonuclease gene RNA1 is tightly controlled in response to phosphate limitation[J]. The Plant Journal，1994，6（5）：673-685.
[16]杜玉杰. 构建分子系统树的简易方法[J]. 生物学通报，2013，48（4）：4-6.
[17]Wang Z，Zhu Y，Wang L L，et al. A WRKY transcription factorparticipates in dehydrationtolerance in Boeahygrometricaby binding to the W-box elements of the galactinol synthase （BhGolS1）promoter[J]. Planta，2009，230（6）：1155-1166.
[18]Panikulangara T J，Eggers-Schumacher G，Wunderlich M，et al. Galactinol synthase1. A novel heat shock factor target gene responsible for heat-induced synthesis of raffinose family oligosaccharides in Arabidopsis[J]. Plant physiology，2004，136（2）：3148-3158.