摘要 热休克蛋白（Heatshock protein，HSP）对鱼类生殖具有极其重要的作用，是提高鱼类产量与影响鱼类繁育成败的关键因素。对热休克蛋白在鱼类生殖中的作用的研究现状进行了概述，从鱼类生殖细胞的发生发育、热休克蛋白的作用机理、热休克蛋白在生殖中的调控机理等方面进行了阐述，并对今后热休克蛋白在鱼类生殖中的研究发展趋势进行了展望，旨在为我国鱼类人工繁殖建立提供科学依据，同时为水养殖鱼类种苗生产提供可控性强的工艺流程。
关键词 热休克蛋白；鱼类；生殖
中图分类号 S96 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-145-03
Abstract Heat shock proteins （heatshock， protein， HSP） plays a very important role in fish reproduction， is key factor to raise fish production， affect the success or failure of the fish breeding. The research status on effect of heat shock protein in fish reproduction are reviewed from the aspects of growth and development of fish germ cell， heat shock protein action mechanism， regulation mechanism of heat shock protein in reproduction， in order to provide the scientific basis for establishment of artificial propagation of fish in China， and to provide the controllability process for aquaculture fish seed production.
Key words Heat shock protein； Fish； Reproduction
鱼类精子和卵子的质量是影响鱼类繁殖性能的关键因素之一。它们与胚胎的发育及仔、稚、幼鱼的成活率和生长都有直接关系，当然，也与后期的养殖效率也密切相关[1]。同时，在鱼类的繁殖过程中精子与卵子质量受到越来越多的关注。许多研究初步证实了热休克蛋白的存在会影响卵子精子的质量。在鱼类生殖细胞形成的过程中热休克蛋白也会随之而表达，但是由于热休克蛋白的形成主要受到环境等外界因素的影响，因此到目前为止如何控制热休克蛋白的表达还未找到更好的方法。为此，笔者从鱼类生殖细胞的发生发育、热休克蛋白的作用机理、影响因素及热休克与生殖细胞的调节机制等方面对目前热休克蛋白对鱼类生殖的影响的相关研究现状进行了概述，并对存在的问题和需要进一步重点研究的相关主题进行了探讨，以期加强热休克蛋白对鱼类生殖细胞的有利影响，进一步优化亲鱼的繁育，进而促进鱼类繁殖的健康、可持续发展，提高我国水产品的产量和质量。
1 鱼类生殖细胞的发生发育
徐红艳等[2]研究表明鱼类和其他大多数动物一样， 胚胎发育产生生殖细胞系或种质系和体细胞系。这2个细胞系的分离发生在胚胎发育的早期， 其标志是形成生殖细胞系的祖细胞， 即原始生殖细胞（Primordial germ cells， PGCs）。PGC形成后从再迁移到性原基，然后就发育成为性原细胞，即卵原细胞和精原细胞；随后在经过配子生成的一系列发育过程后，最终产生成熟的配子——卵子和精子。生殖细胞发育的每个步骤都可能影响生物个体的生殖能力或育性。在鱼类及许多其他的生物中，生殖细胞在胚胎发育早期就已形成而且是由原原始生殖细胞（pPGC） 发育而来的[2]。pPGC是生殖细胞的始祖，能进行细胞不对称分裂，产生2个“命运各异”的子细胞： 其中1个是体细胞，而另1个仍为pPGC。但当2个子细胞“命运相同”且都能发育成生殖细胞时，其母细胞就成为了原始生殖细胞（PGCs）。在生殖腺形成前，PGC 便已在胚胎的特定位置特化形成，随后PGC 迁移穿过各种胚胎组织（细胞组织）到达正在形成中的原始生殖腺，即性原基。因此，PGC 可相应地分为迁移前、迁移中和迁移后3 种。一旦到达性原基，PGC 便结合并协同周围体细胞形成一个完整的生殖腺[3]。在某些物种的初始生殖腺，如老鼠的初始生殖腺中PGC到达性原基后便会停止有丝分裂且进入有丝分裂静止期（G0）期。这些G0期生殖细胞通常也被称为生殖母细胞或性原细胞，在鱼类性成熟期间生殖母细胞发育变成生殖干细胞（卵原细胞或精原细胞），在性成熟期间最终分化形成成熟的配子，即在雄性个体中形成精子，在雌性中形成卵子。在研究初期，有人用显微镜观察形态学的方法分析了PGC的特有细胞结构——生殖质颗粒（Nuage），并对多种鱼的生殖细胞进行了初步考察。同时，Hamaguchi在细胞超微结构水平上对生殖质颗粒在鱼类生殖细胞发育期间的形成进行了观察研究[4]。在10 年前这些开创性研究就得以被归纳与总结。 随后，其他一些鱼类生殖细胞特异基因也陆续被分离鉴定。此外，各种细胞和分子实验技术也在鱼类研究应运而生并得以发展，使得在过去10年内科学界对生殖细胞的研究无论是在理论知识的积累方面还是实践应用方面都取得了很大进步[5]。
2 热休克蛋白的作用机理
热休克蛋白（Heat shock protein，HSPs） 是一类结构上高度保守的蛋白质，广泛存在于从原核类的细菌到哺乳动物的细胞中[6]。当细胞受环境刺激（温度的升高、缺氧、病毒感染、营养缺乏、暴露于化学物质下）时，即可产生此类蛋白。因此，热休克蛋白又称为应激蛋白。各种生物的热休克蛋白在进化上均具有高度的保守性，甚至其编码基因的进化也是如此。人类与细菌类的热休克蛋白具有50%以上的同源性[7]。对应激后热休克蛋白的表达方式和种类进行研究，有人用哺乳动物5种不同种系细胞热休克后热休克蛋白的表达进行试验，结果发现它们的表达方式和种类极其相似。
目前，对于HSP尚无明确的分类标准。一般根据应激蛋白的调节模式不同，通常分为2大类：HSP和调节蛋白（CRPs）。另外，也有研究表明，可以根据相对分子质量的大小及同源程度，将其分为 4 个家：HSP90家族（分子量 83～90 kD）、HSP70 家族（分子量66～78 kD）、HSP60 家族和小 HSP 家族以及分子量分别为110～111 kD和相对分子质量8 000，且性质不同于上述家族的大分子 HSP和泛素蛋白[8]。
3类蛋白质HSP90、HSP60和HSP70都有各自的结构和生物学功能，但是现在对HSP的研究中对HSP70家族的结构、功能以及表达调控机理的研究较为深入，在正常情况下HSP70位于细胞浆内，当细胞受到热休克的刺激时细胞内只有少量存在，细胞处于恢复阶段时细胞核内的HSP70就会消失，但是细胞浆内仍有低水平的HSP70表达。HSP家族中，HSP70 家族是一类最保守也是最重要的，包括分子量为68、72、73、75、78 kD 的多种蛋白，用双向电泳和质谱分析对其进行分析，发现其具有相同的酸性等电点和相近的胰蛋白酶肽谱[9]。HSP70基因分布广泛，位于第1、5、6、14及21号染色体上，其表达和分泌的蛋白具有ATP酶区和底物识别区2 个结构域[10]。这种结构特点不但能使HSP70可利用ATP水解产生的能量，还能与其他功能蛋白进行结合、分离，最终能够完成蛋白的转运、合成以及变性蛋白的清除。
HSP对温度有一定的敏感性，如当环境温度高于细胞生长温度2～8 ℃时，HSP会在细胞内迅速积累。在此温度范围内，细胞内的HSP基因转录迅速增加，其他基因的转录降低，接着HSP mRNA选择性转录，HSP也就会随之增加[11]。HSP基因在应激时细胞内的激活机制在进化上是非常保守的。有人认为热休克因子与热休克原件的结合及HSP基因的转录是真核细胞HSP基因的转录调节过程。
3 热休克蛋白及其在生殖中的作用
3.1 热休克蛋白在生殖组织中的表达
人类与生殖相关的许多组织中均有HSPs的存在。在健康女性的周期性变化的子宫内膜中就有HSPs的表达。在孕早期的人类蜕膜中就可以检测到HSPs。无论是正常的还是异常的怀孕妇女的输卵管中都可检测到不同的HSPs。排卵后，子宫内膜中表达大量的HSP27、HSP60和HSC70。研究表明，雌激素和孕酮的受体都与HSP有关，这些HSPs在子宫内膜中表达暗示它们参与对激素功能的调节[12]。
3.2 热休克蛋白的精子发生
精子发生过程中有3个不同并且重要的阶段：精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂和圆形精子的发育及精子成熟期[4]。大量的转录和细胞分化事件在这些不同的发育阶段都会发生，因此伴随着不同的HSPs的表达。在不育的雄性动物中，由HSP60的低水平表达导致了保护水平的降低。研究发现，减数分裂的失败与精原细胞的凋亡的增加有关，在小鼠精子形成过程中需要HSP70-2基因的参与才能完成减数分裂。HSP70 可能作为精子表面抗原，与支原体感染性不育症中对硫糖脂基团的识别，主要是 HSP70和导致不育症的多种支原体都有与硫糖脂基团结合专一性，而硫糖脂基团可以有效阻止精卵的结合[11]。但是，也有人认为在不育的动物中HSP70表达的增加可能是在精子凋亡过程中起到一种保护作用。HSP70 水平还可能与精液质量相关，如果在精液中加入HSP70 抗体，卵母细胞的受精率则呈浓度依赖性降低[13]。
4 热休克蛋白对鱼类生殖细胞的作用机理
鱼类在生殖的过程中，首先要产生精子和卵子才能完成受精。研究发现，鱼类的生殖细胞从原始生殖细胞的形成，然后再转变成卵原细胞和精原细胞，最后在形成成熟的配子过程中细胞都进行了大量的转录和分化，同时也伴随着不同的HSPs的表达[8]。由于它的存在参与了蛋白的折叠、装配及运输等活动，对调控细胞的生长、存活及分化起着重要作用，因此影响了鱼类精子和卵子的形成。有些雌性鱼类不育主要是因为HSP60的低水平表达导致了保护水平的较低，使卵细胞无法形成而影响受精过程。在雄鱼精子形成的过程中，需要HSPs家族中的一些基因的参与才能完成减数分裂，如果减数分裂失败就会导致精子的凋亡。
4.1 热休克蛋白在雄性鱼生殖中的作用
有学者认为，在雄性鱼类精子形成的过程中热休克蛋白中HSP70对精子的形成有很大的影响作用。但也有人认为，在不育的雄鱼中HSP70表达的增加可能是在精子凋亡过程中起到一种保护作用[12]。另外，有研究表明有机磷化合物敌敌畏等可使雄性果蝇的HSP70 仅限在睾丸中表达，而那些附属腺不表达HSP70 的雄性果蝇，其睾丸则损伤明显。HSP70 水平还可能与精液质量相关，在炎热的季节鱼精子HSP70表达较低，精液质量也明显下降[14]。在精液中如果加入HSP70 抗体，卵母细胞的受精率则呈浓度依赖性降低[15]。HSP70 抗体可以明显降低精子与牛卵细胞透明带结合的能力，也无法完成卵细胞的第2次减数分裂及原核的形成[16]。
4.2 热休克蛋白在雌性鱼生殖中的作用
无管是正常的还是异常的排卵，雌性鱼的输卵管中亦可检测到不同的HSPs。排卵后，排卵腔中表达大量的HSP27、HSP60和HSC70。研究表明，雌激素受体与HSP 有密切关系，这些HSPs 在子排卵腔中表达暗示它们参与了对激素功能的调节[17]。
HSPs 可以保护细胞免受由细胞因子引起的细胞毒性损伤[18]。在子生殖腔中，白细胞可以产生高水平的氧自由基（ROS）和细胞因子，这2种产物可以调节HSPs 的表达[19]。因为白细胞和细胞因子[如肿瘤坏死因子（TNF-A）]在分泌期急剧聚集，此时随之出现的HSPs可能是保护子排卵膜细胞免于白细胞积聚和细胞因子释放所造成的细胞损害[18]。当细胞转染HSP70后，可以保护细胞免于TNF-A引起的毒性损害[17]。此外，HSP70可能可以防止细胞DNA 链的断裂，保护线粒体的结构和功能，并由此抑制细胞的凋亡。
5 热休克蛋白在鱼类生殖中存在的问题
综上所述，作为精子、卵子发生和成熟过程中关键蛋白伴侣分子的 HSP，在鱼类生殖的过程中扮演者重要的角色。①参与精母细胞和卵母细胞的减数分裂和转录过程；②促进生殖细胞的分化；③改善生殖细胞的质量。根据HSPs表达方式的不同可以分为2种类型：一类是在应激条件下表达的，另一类是在生理条件下表达的[8]。因此，虽然HSPs在生殖过程中有很重要的作用，但也存在很大的弊端。鱼类主要营水生生活，外部环境对鱼的刺激条件很多，含有很多的未知因素，而且不易控制，刺激强度过大或过小都对HSPs的表达和积累有很大的影响，从而可能会导致鱼的生殖出现问题。
6 展望
在鱼类繁殖的过程中，改善繁殖的技术有很多，而通过控制热休克蛋白的表达来提高鱼类生殖细胞也是一种极其有效的方法。虽然目前人类对这方面的研究还有许多问题尚未解决，但是随着研究的逐步深入，鱼类生殖细胞的发生、发育和成熟与热休克蛋白在不同阶段的表达及调节机制将愈来愈清晰。大量研究表明，母源性基因产物（母源mRNA和蛋白）对鱼类生殖细胞的发生和早期胚胎的发育的调控起主导作用，而基因产物的蛋白质部分就是热休克蛋白，环境变化等非基因因素的调控等因素也对其表达有所影响，但如何控制这些因素仍不清楚。因此，在未来研究鱼类繁殖的过程中如何通过外界环境来控制热休克蛋白的表达改善鱼类生殖细胞和提高鱼类产量是值得关注的问题之一。
参考文献
[1]张雅芝，郑金宝，谢仰杰，等.花鲈仔、稚、幼鱼摄食习性与生长的研究[J].海洋学报，1999，21（5）：111-118.
[2] 徐红艳，李名友，桂建芳，等.鱼类生殖细胞[J].中国科学：生命科学，2010，40（2）：124-138.
[3] 林浩然.鱼类生理学[M].广州：中山大学出版社，2011：237-324.
[4] 杨增明，孙青原，夏国良.生殖生物学[M].北京：科学出版社，2005：7-136.
[5] VOLPE S，GALEATI G，BERNARDINI C，et al.Comparative immunolocalization of heat shock proteins （Hsp）-60，-70，-90 in boar，stallion，dog and cat spermatozoa [J].Reprod Domest Anim，2008，43（4）：385-392.
[6] 黄晓晖.甲基强的松龙对脊髓损伤后hsp27基因表达的影响[D].福州：福建医科大学，2009.
[7] 张永亮，吴家胶，吴梅.热休克蛋白的分类、基因调控及其功能[J].法医学杂志，1999，15（4）：239-242
[8] 苑金乡，李延森，冯道俊.热休克蛋白及其在生殖中的作用[J].潍坊学院学报，2006，11（6）：1671-4288.
[9] 柳葳.酿酒酵母Hsp33蛋白的晶体结构解析[D].合肥：中国科学技术大学，2007.
[10] 朱晔敏，丁之德.雄性生殖中热休克蛋白作用的研究进展[J].国际生殖健康，2010，25（3）：182-185.
[11] 赵晓俊，李雅娟，顾蔚.果蝇精子发生相关基因及其功能调控[J].生理科学进展，2013，44（2）：138-142.
[12] ERATA GO，KOCAK TOKER N，DURLANIK O，et al.The role of heat shock protein 70 （HSPs 70）in male infertility： is it a line of defenseagainst sperm DNA fragmentation[J].Fertil Steril，2008，90（2）：322-327.
[13] 张勇亮，吴家胶，吴梅药.热休克蛋白的分类、基因调控及表达[J].法医学杂志，1999，7（4）：524-530.
[14] KIANG J G，TSOKOS C C.Heat shock protein 70 kDa： molecular biology，biochemistry，and physiology[J].Pharmacology Therapeutics，1998，80（2）：183-201.
[15] SPINACI M，VOLPE S，BERNARDINI C，et al.Immunolocalization of heatshock protein 70（HSP 70）in boar spermatozoa and its role during fertilization[J].Mol Reprod Dev，2005，72（4）：534-541.
[16] 焦传珍，王在照，李富花，等.编码中国明对（Fenneropenaeus chinensis）一种组成型热休克蛋白 70（HSC70）的cDNA 克隆测序及其表达分析[J].科学通报，2004，72（4）：534-541.
[17] 黄晓，郭一清，程汉华，等.利用差减杂交分离具有进化保守性的睾丸表达的基因[J].动物学报，2002，48（6）：833-836.
[18] TABIBZADEH S，BR OOME J.H eat shock pr oteins in humanendomet rium thr oughout the menst rual cycle[J].Infect Dis Obstet Gynecol，1999，7（1/2）：5-9.
[19] JACQUIERSARLIN M R，FULLER K，et al.Experientia protective effects of hsp70 iniflammation[J].Experientia，1994，50（11/12）：1031-1038.