摘要：目前报告基因作为一种有效技术已在农学、生物医学、生命科学和环境科学等领域起着重要的作用。现以荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。
关键词：报告基因；荧光素酶；绿色荧光蛋白
中图分类号：R962文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0045-04
报告基因（report gene）是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：（1）基因被克隆并且已知全序列；（2）宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；（3）表达产物易被检测；（4）报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化[1]；（5）报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。现主要以目前应用最广泛的报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。
1荧光素酶（luciferase，luc）
luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶（bacterial luciferase，BL）、萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，FL）以及以海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。BL是由2个多肽亚基组成的异源二聚体，相对分子质量约为79×103，在还原性黄素（FMNH2）、八碳以上长链脂肪醛（RCHO）和氧分子（O2）存在时，发射出蓝绿光（450～490 nm）。FL由单一的多肽链组成，相对分子质量为（60～64）×103，在Mg2+、ATP、O2 存在时催化D-荧光素（D-Luciferin）氧化脱羧发光（550～580 nm）[2]。由于luc的检测方法简便，灵敏度高，因而成为目前应用最广泛的报告基因之一。
1.1基因表达研究
目前检测luc的灵敏度可达到10～19 mol且价格相对较低，是基因表达研究中首选的报告基因。娄桂予等[3]用luc作报告基因，研究肝细胞核因子1α（HNF1α）对人胆汁酸受体（FXR）转录激活的作用机制，发现HNF1α与FXR启动子区域-65到-48的反向半位点结合，发挥反式激活作用，从而调控FXR基因表达。徐春娥等[4]将获得的IFN-β启动子基因连入pGL3-Enhancer载体，用luc作报告基因构建了质粒IP-21，将IP-21瞬转入稳定表达有SARS-CoV非结构蛋白3a和7a的CHO细胞，观察3a和7a对干扰素诱生途径的影响。结果显示，3a和7a蛋白增强了荧光素酶的表达，说明3a和7a能有效激活IFN-β的启动子部分。
1.2蛋白质间相互作用研究
作为一种酶性报告基因，luc对标记对象和宿主没有损害。特别是可视化检测技术的发展使空间定位观察成为可能，为研究蛋白质的磷酸化、空间表达及蛋白质间的相互作用提供了新的途径。北京大学精神卫生研究所利用嵌合酵母活性转录因子(Gal4)-单纯疱疹病毒蛋白(VP16)-上游激活序列(UAS)和双荧光素酶报告基因系统，建立了检测γ-分泌酶切割阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）中β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein, Aβ）活性的方法，有效可靠，灵敏度高[5]。
1.3毒性物质检测研究
传统的利用luc检测毒性物质的原理是毒性物质可能会抑制发光菌发光，根据发光强度的变化判断抑制物毒性作用的大小。但此种方法应用范围较窄，实际操作受限。随着分子生物学技术的发展，人们开始利用基因工程技术将luc报告基因插入某些特异性敏感的基因序列中，构建会发光的生物传感器检测环境中的毒性物质。目前美国Xenobiotic Detection System Intermational公司利用FL作报告基因开发出一种转基因细胞，用于测定样品中二恶英的总毒性当量（total toxic equivalencies，TEQ）。研究表明，二恶英类化合物（dioxin2like chemicals，DLCs或DXNs）产生毒性作用必须与机体细胞核内的二恶英反应增强子结合。根据这一原理，将FL融合入哺乳动物细胞的细胞色素P450基因（CYP1A1）作为报告基因，再转染入H4ⅡE大白鼠肝癌细胞系表达。当外源性DXNs污染物透过细胞膜特异性地与染色体上二恶英应答区域结合，激活细胞色素P450基因和FL基因合成荧光素，此时的荧光强度与DXNs物质的量成正比，就可根据系统的荧光强度分析DXNs的TEQ[6]。
1.4RNA干扰研究
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发，同源mRNA高效特异性降解的现象，是一种典型的转录后基因表达调控方式。由于研究有巨大的潜力，Science杂志将其评为2001年的10大科学进展之一，并名列2002年10大科学进展之首。与此同时用luc作报告基因研究RNAi也迅速成为研究热点。尹志华等[7]用GFP和luc作报告基因，通过体外转录合成短干扰RNA（small interference，siRNA）和构建表达短发夹RNA（small hairpin，shRNA）的质粒载体2种方法，检测鼻咽癌细胞系的RNAi作用，获得了理想的效果。何国平等[8]将外源报告基因GFP和luc的表达载体与shRNA的质粒共转染HEK293H细胞后，观察shRNA对报告基因的抑制作用，研究在RNAi技术抑制外源报告基因过程中的剂量和时间效应。发现在一定剂量范围内，RNAi载体抑制效应与干扰载体剂量大小相关，但当剂量加大到足以抑制外源基因表达时，抑制效应将维持在“平台期”。这为今后RNAi技术的应用研究提供了有价值的理论参考依据。
2绿色荧光蛋白（green flourscent protein, GFP）
GFP是一种由238个氨基酸组成的单体蛋白质，相对分子质量为27×103。它具有分子小，荧光稳定，检测方便，而且对活细胞无伤害等优点，成为众多报告基因中的后起之秀，被称为“活细胞的分子探针”。
2.1转基因研究
目前所有的研究结果表明，GFP对目的基因的功能无影响，大量表达对细胞也无毒性，细胞仍能连续传代培养，GFP无论是作为瞬时表达还是长久表达的标记物都是安全的。而且通过GFP的荧光强弱反映表达产物的表达量，易检测，灵敏度高。David等[9]将GFP/β牛乳糖（lacZ）报告基因融入支架中再进入到线虫C.elegans热休克蛋白（heat-shock proteins，hsp）16基因，使此报告基因的表达在hsp 16启动子的转录控制下。目前已将表达hsp16-GFP-lacZ融合蛋白的C.elegans用于环境检测。Zhang等[10]将携带GFP表达构件的拟人免疫缺陷病毒注射入鼠受精卵细胞，然后移植入代孕母体的输卵管，获得了GFP转基因幼鼠。经过PCR扩增，荧光显微镜和流式细胞仪分析，发现转基因整合率达到40%。实时PCR分析表明，整合GFP构件的拷贝数量约为40。原位荧光杂交分析表明，整合形式是随机的，但可遗传。这种多整合位点和多表达水平的转基因鼠成为实践和研究中的有效工具。Zhang等[11]利用未分化的体细胞核移植技术制成了表达GFP的猪克隆转基因胚胎。
2.2细胞定位研究
与传统的定位方法相比，GFP荧光反应不需要外加底物和任何辅助因子，也就不存在这些物质难于进入细胞的问题。这种非破坏性的检测方法对实验本身极为有利。李铁等[12]在哺乳动物细胞中表达了PS1/GFP融合蛋白，以GFP绿色荧光作为PS1亚细胞定位的信号，初步获得PS1全长蛋白质在细胞中定位的部分信息。鲁文果等[13]用GFP标记小鼠胚胎干细胞（mESCs），研究它在脑出血大鼠脑内的存活与分化，初步得出小鼠胚胎干细胞有向神经细胞分化能力的结论。
卫星细胞在成体内主要参与成熟骨骼肌的修复。Day等[14]用nestin增强子和GFP构建了nestin-GFP报告基因，发现GFP表达受小鼠卫星细胞nestin基因调节，而且随着卫星细胞的激活，nestin-GFP表达量降低，因而能用nestin-GFP的表达来报告静止的骨骼肌卫星细胞的静止状态。为了研究星状毛囊滤胞增殖过度细胞（folliculo-stellate cells, FS cells）的功能和来源，Itakura等[15]制成了表达在S-100β蛋白基因启动子控制下GFP的转基因鼠，因而能在活体内检测FS细胞，成为研究FS细胞的优良模型。
2.3药物筛选研究
利用GFP作为报告分子，很容易从众多化合物中筛选与信号分子功能相似的化合物，使药物筛选过程简单方便、可信度高。Nagy等[16]介绍了Ah（ary hydrocarbon）受体激动剂的成像。Ah受体是一个配基依赖的转录E-GFP因子，介导多环和芳香卤化类的有机化合物如二恶英的生物学作用和毒性作用。用一个包含完整Ah受体应答E-GFP报告基因的HepG2细胞系，可筛选此受体的激动剂。目前还有报道，将GFP与其它荧光蛋白形成荧光共振用于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）实验。FRET是指激发态的荧光分子通过偶极作用把激发态能量转移给吸收分子的现象，能够描述荧光供体蛋白和荧光受体蛋白之间非辐射的能量转移。FRET是观察生物大分子的新技术，可跟踪结构变化、分子解离程度及生物大分子之间的距离，对其相应的生物学功能进行定性、定量检测。随着使用材料、技术和方法的不断改进，近年FRET已用于药物筛选。Bevan等[17]报道了用GFP的FRET实验描述γ-氨基丁酸GABA-B受体的2个亚单位的相互作用，通过此模型能筛选相应受体的调节剂。由于白细胞间介素-3（Interleukin-3，IL3）mRNA存在失稳的多AU元件（AU-rich element，ARE），因而是固有易变的。Benjamin等[18]以GFP作报告基因将其融入全长IL3 3＇ UTR不翻译区构建了一个灵敏的报告系统，研究IL3 mRNA的退火和失稳。这个报告系统用来筛选和识别稳定ARE-mRNA的化合物。
3展望
报告基因作为一种有效的技术手段目前已在农学、生物医学、生命科学和环境保护等领域发挥重要作用，它是目的物定位、表达、转移的风向标。随着技术的发展和研究的深入，报告基因种类的增多及检测方法的不断完善，在今后的研究中必将发挥更广泛的作用。
参考文献
[1]薛丽香，童坦君，张宗玉. 报告基因的选择及其研究趋向[J]. 生理科学进展，2002，33（4）：364-366.
[2]杨颖，张逢春. 荧光素酶的分类、结构与应用[J]. 北华大学学报（自然科学版），2006，7（5）：411-415.
[3]娄桂予，陈敏，陈彬，等. HNF1α对人FXR启动子的调控作用[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2006，22 （12）：966-972.
[4]徐春娥，付玲，侯丽华，等. 人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究[J]. 中国生物工程杂志，2006，26（12）：6-10.
[5]刘忠华，阮燕，查芹芹，等. 利用Gal4/VP16-UAS和双荧光素酶报告基因系统检测γ-分泌酶活性[J]. 现代生物医学进展，2006，6（3）：1-4.
[6]王承智，胡筱敏，石荣，等. 二恶英类物质的生物检测方法[J]. 中国安全科学学报，2006，16（5）：135-142.
[7]尹志华，任彩萍，李峰，等. 利用报道基因检测鼻咽癌细胞的RNAi干扰作用[J]. 癌症，2005，24（3）：371-375.
[8]何国平，张思仲，王英成，等. 短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究[J]. 生物化学与生物物理进展，2005，32（3）：258-267.
[9]David H E, Dace A S, de Pmierai D L, et al. Construction and ecaluation of transgenic hsp16-GFP-lacZ Caenorhabditiditis elegans strain for environmental monitoring[J]. Environ Toxicol Chem, 2003, 22: 111-118.
[10] Zhang J Z, Guo X B, Xie S Y, et al. Production of transgenic mice carrying green fluorescence protein gene by a lentiviral vector-mediated approach[J]. Prog Nat Sci,2006, 08(16): 827-833.
[11] Zhang Y, Pan D, Sun X, et al. Production of porcine cloned transgenic embryos expressing green fluorescent protein by somatic cell nuclear transfer[J]. Sci Sin(c),Life Sci, 2006, 49(2): 164-171.
[12] 李铁，李佳慧，宁丽峰，等. PS1/GFP融合蛋白对PS1的亚细胞定位的初步研究[J]. 中国生物工程杂志，2006，26（6）：17-22.
[13] 鲁文果， 王东， 陈红，等. GFP+小鼠胚胎干细胞移植入脑出血大鼠脑内后存活与分化的研究[J]. 中国康复，2006，21（4）：219-212.
[14] Day K, Shefer G, Richardson J B, et al. Nestin-GFP reporter expression defines the quiescent state of skeletal muscle satellite cells[J]. Dev Biol, 2007, 304(1): 246-559.
[15] Itakura E, Odaira K, Yokoyama K, et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100 beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes[J]. Endocrinology，2007, 148(4): 1518-1523.
[16] Nagy S J, Liu G, Lam K S, et al. Identification of novel Ah receptor agonists using a high-throughput green fluorescent rotein-based recombinant cell bioassay[J]. Biochemistry, 2002, 41: 961.
[17] Bevan N, Rees S. Pharmaceutical applications of GFP and RCFP[J]. Methods Biochem Anal, 2006, 47: 361.
[18] Benjamin D, Colombi M, Stoecklin G, et al. A GFP-based assay for monitoring post-transcriptional regulation of ARE-mRNA turnover[J]. Mol Biosyst, 2006, 2(11): 561-567.
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