[摘要] 目的 联用多重连接酶依赖探针扩增技术（MLPA）和基因测序技术，对地中海贫血病患者进行基因诊断。 方法 回顾性分析2011年10月～2013年2月来深圳市坪山新区人民医院就诊的地中海贫血病患者110例，先对他们进行基因检测，再对他们进行MLPA技术。 结果 通过基因检测，α1型地中海贫血病21例，α2型地中海贫血病27例，β型地中海贫血病62例。在62例β型地中海贫血病患者中，21例（33.9%）合并α型地中海贫血病双重杂合子，41例（66.1%）是41～42杂合基因型。通过MLPA检测，又发现16例（14.55%）α型地贫缺失型。 结论 发现运用基因测序技术能检测到大部分的地中海贫血病，再联用多重连接酶依赖探针扩增技术能更准确的检测到全部地中海贫血病，所以联用多重连接酶依赖探针扩增技术和基因测序技术是检测地中海贫血病有效的方法，为以后的临床检测提供了依据。
[关键词] 地中海贫血；MLPA技术；基因测序技术
[中图分类号] R556.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（a）-0019-02
我国常见的遗传性血液病有很多种，其中之一就是地中海贫血病。在我国，地中海贫血病的高发地区主要集中在广东、广西、海南和福建等省份。在世界范围内保守估计[1]，有近2亿人携带此病基因[2]，它已被世界卫生组织列为危害人类健康的6种常见病之一。如果夫妇双方都携带地贫基因，按照基因重组定律，他们子女就会有25%的可能是重型地中海贫血，50%的可能是轻型地中海贫血，另有25%才属于正常。按照现有的医疗技术水平，尚无有效治疗地贫的方法，只有通过遗传筛查和产前诊断才能有效杜绝重症地贫患儿的出生[3]。本文回顾性分析了地中海贫血病患者110例，目的是联用MLPA技术和基因检测技术，对地中海贫血病患者进行基因诊断。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2011年10月～2013年2月来深圳市坪山新区人民医院就诊的地中海贫血病患者110例，其中男56例，女54例，年龄21～56周岁，平均（34±3.4）周岁。在110例地中海贫血病患者中，重型41例，轻型69例。
1.2 方法
1.2.1 基因测序 将目的基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，具体为，PCR反应体系为每管10 μL，提纯的人体DNA 样本1 μL，上下游引物各1 μL，1 μL 10×loading buffer，1 μL的酶，剩余量用ddH2O补足。PCR反应程序为，92℃ 2 min，（92℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s）进行35个循环，最后4℃保存。再将基因扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后观察，拍照。
1.2.2 MLPA检测 根据MLPA试剂盒说明书步骤进行实验。先进行PCR扩增，具体步骤为，PCR反应体系为每管10 μL，提纯的人体DNA样本1 μL，上下游引物各1 μL，1 μL 10×loading buffer，1 μL的酶，剩余量用ddH2O补足。PCR反应程序为，92℃ 2 min，（92℃ 25 s，55℃ 15 s，72℃ 40 s）进行35个循环，最后4℃保存。再取扩增产物2 μL加上甲酰胺和Ladder，加热5 min，最后放在冰上10 min。最后进行电泳，时间为2 h。电泳完后用相关软件进行分析。
2 结果
2.1 基因检测结果
对110例基因进行检测，α1型地中海贫血病21例，α2型地中海贫血病27例，β型地中海贫血病62例。在62例β型地中海贫血病患者中，21例（33.9%）合并α型地中海贫血病双重杂合子，41例（66.1%）是41～42杂合基因型。
2.2 MLPA检测结果
通过MLPA检测检测又发现16例（14.55%）α型地贫缺失型。因为通过普通的基因检测结果所发现的地中海贫血病基因缺失型仅仅只能包括中国人的90%，再加上MLPA检测，基本就能覆盖全中国人。
3 讨论
地中海贫血病属于遗传性疾病，主要由基因缺陷导致的，鉴于现有的医疗水平，彻底根治此病尚有难度。所有对于地中海贫血病的预防已经受到外国的重视。所以许多发达国家例如希腊、撒丁尼亚岛、意大利和塞普路斯等从20世纪70年代起采取对地中海贫血病的预防措施，如普及地中海贫血病的病例知识，加强实施卫生教育、加大对地中海贫血病筛查力度等方法，很好地控制了地中海贫血病在这些国家的发病率。甚至在有些国家地中海贫血病发病率降低到了0%，比如在意大利，年轻夫妇从临床医生和卫生部门学习到关于遗传风险的知识，从而能更好地选择生育时机，降低了地中海贫血病的发病率。亚太地区如新加坡等也是地中海贫血病的重灾区，这些国家学习欧洲先进的预防方法和干预手段，也大大降低了地中海贫血病的发病率，已经接近了0%。在中国，地中海贫血病高发地区是广州，卫生部门已对此有了高度的重视，也制定了相关的预防措施，力图最大程度地降低地中海贫血病的发病率。
预防地中海贫血病的关键就是能否有效地检测和筛查出地中海贫血病缺陷基因的携带者[4]。一旦准确地检测和筛查出地中海贫血病缺陷基因的携带者，就能指导他们进行合理的婚配和生育，就能预防地中海贫血病基因缺陷的胎儿出生，所以提高地中海贫血病缺陷基因的检测和筛查水平有重要的意义。
血红蛋白电泳与血液学筛查是诊断地中海贫血的常用方法[5]。如用这两种方法发现地中海贫血的疑似病例，就再通过基因检测的方法确定是否为地中海贫血病基因缺陷。这一些系列的方法准确度比较高，能发现中国人中90%的地中海贫血病基因缺失型。PCR法和反向斑点杂交技术是基因检测中常用的两种方法[6]。国际上检测α型地中海贫血基因缺失的方法主要是单管多重PCR法，方法就是在一个PCR反应体系里加入多对反应引物，大概有3～4对，这样能同时检测多对等位基因，一般能同时检测出3种地中海贫血病基因缺失，但对非缺失型基因，漏检率较高。反响杂交发能检测β型地中海贫血病的基因突变。这种方法能在同一张膜上同时检测17～18对等位基因的突变，大大提高了工作效率，但漏检率也不低，所以用PCR法和反向斑点杂交技术等基因检测的方法还存在一定的漏洞，检测率还不能达到100%。
据文献报道，一种全新的检测技术已问世，它就是多重连接酶依赖探针扩增法，它能在一个Eppendorf管里准确地检测40多个基因序列[7]。现在已经将此种方法引入到地中海贫血基因检测领域[8]，发现它能快速准确地检测出β地中海贫血的基因缺失和α地中海贫血缺失型。
多重连接酶依赖探针扩增法的原理是这样的，先设计出多对与目的序列互补的探针，它们一般能有效覆盖真个目的序列[9]。再进行PCR扩增，得到40多种不同的DNA序列。最后进行电泳分析，检测出缺陷基因。它的强大之处在于能同时检测出所有的缺陷基因。对于检测地中海贫血缺陷基因，多重连接酶依赖探针扩增法能同时检测出α基因缺陷型和β缺陷型的基因[10]，而且运用这种方法能检测到人类所有的β珠蛋白基因（HBB）和正常的血红蛋白基因（HbA）突变，很好地弥补了血红蛋白电泳、血液学筛查和PCR法[11]、反向斑点杂交技术这几种方法的技术缺陷[12]。
通过本文的研究，发现运用基因测序技术能检测到大部分的地中海贫血病，再联用多重连接酶依赖探针扩增技术能更准确的检测到全部地中海贫血病，所以联用多重连接酶依赖探针扩增技术和基因测序技术是检测地中海贫血病有效的方法，为以后的临床检测提供了依据。
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（收稿日期：2013-04-18 本文编辑：卫 轲）